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背景资料Kojima等人在1999年纯化了一个由28个氨基酸组成的肽,该肽是生长素促分泌物受体(growth hormone secretagogue receptor, GHS-R)的激动剂,被命名为"Ghrelin"。该分子在丝氨酸残端含有一个辛酰基,这一结构特点是Ghrelin发挥其生物活性所必须的。Ghrelin主要由胃的内分泌细胞产生,然后释放入外周血液循环,同时在下丘脑的弓状核及临近第三脑室的神经元中相继被发现。Ghrelin可与GHS-R结合促进生长素的分泌,同时还具有促进摄食、增加体重,参与体重和能量稳态的长期调节作用。许多研究表明,ghrelin具有启动摄食的生理作用,Ghrelin促进食欲的作用机制,尤其是Ghrelin在中枢神经系统(central nervous system, CNS)的作用位点,成为关注的焦点。目前绝大多数研究证实Ghrelin刺激摄食的作用靶点是下丘脑弓状核(arcuate nucleus, ARC)“神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)/刺鼠色蛋白相关蛋白(agouti-related peptide, AgRP)’’神经元,药理学试验证据也表明了ghrelin促进摄食作用主要是通过中枢神经系统NPY/AgRP所介导。此为Ghrelin诱发多食反应的前脑机制。尽管有很多证据支持ghrelin的主要作用靶点是下丘脑的ARC,但J.M. Zigman等采用原位杂交的实验证实了在脑干迷走复合体(dorsal vagal complex, DVC)的三个组成部位(孤束核、最后区、迷走神经运动背核)均有GHS-R的存在。Faulconbridge等报道在第三脑室和第四脑室注入ghrelin (150p mol)引起几乎相同程度的摄食增加,而且DVC单侧微量注射ghrelin (10p mol) 3h后引起摄食增加的程度与ARC注射Ghrelin(30pmol)所引起的摄食增加程度是一样的。由此推断,Ghrelin还可能通过脑干机制发挥作用,那么脑干DVC注射ghrelin促进摄食的机制是什么呢?这有待于我们做进一步的探讨。目的探讨作用于DVC的Ghrelin是否也是通过弓状核NPY/AgRP神经通路最终促进摄食活动?以进一步明确DVC Ghrelin诱发摄食的脑干机制。方法1.摄食测定选择健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(250g～300g)32只,随机分成2组,Ghrelin组(n=16,DVC注射20pmol Ghrelin)和生理盐水组(n=16,DVC注射0.5μl无菌生理盐水)。各组大鼠先行DVC埋管手术,术后恢复7d进行实验,实验前3天注射3次生理盐水以适应实验环境。采用自动摄食分析仪(Feeding and Activity Analyser 47552-002, UGO BASILE, ITALY)分别测定大鼠DVC微量注射Ghrelin(或生理盐水)20 pmol后1h、2h、3h和4h累积摄食量的变化。2.荧光定量PCR测定下丘脑弓状核NPY/AgRP mRNA的表达72只雄性SD大鼠随机分成2大组,即Ghrelin组和对照(生理盐水)组,每组又根据注射后检测间隔时间的不同随机分为三个亚组,即1小时(1h)组、2小时(2h)组、3小时(3h)组,每组各12只大鼠。各组大鼠先行DVC埋管手术,术后恢复7d进行实验,实验前3天注射3次生理盐水以适应实验环境。Ghrelin组DVC微量注谢20pmolghrelin,对照组DVC微量注射等体积生理盐水。每组分别于注射后1h、2h、3h取大鼠下丘脑弓状核提取RNA,应用荧光定量PCR技术分别检测不同组别大鼠下丘脑弓状核NPY/AgRP mRNA的表达水平。3.免疫组化检测NPY神经元的表达16只雄性SD大鼠随机分成2组,Ghrelin组和生理盐水组(每组n=8),各组大鼠先行DVC埋管手术,术后恢复7d进行实验,实验前3天注射3次生理盐水以适应实验环境。Ghrelin组DVC微量注射20pmol ghrelin,对照组微量注射等体积生理盐水。每组大鼠分别于注射后1h、2h、3h断头取脑,冰冻切片进行免疫组化染色,镜下观察下丘脑弓状核NPY免疫阳性神经元的染色情况,并通过计算机系统计算NPY阳性神经元数量及光密度。结果Ghrelin组大鼠1h、2h、3h的累积摄食量明显高于盐水组1 h：(0.92±0.99)g vs(0.61±0.13)g,P<0.05；2 h：(2.03±0.10)g vs (1.21±0.17)g,P<0.01；3 h：(2.38±0.11)g vs (1.62±0.19)g,P<0.05],2h的累积摄食量达高峰,注射后4h Ghrelin组大鼠的累积摄食量与盐水对照组无显著性差异。Ghrelin组1h、2h、3h大鼠下丘脑弓状核NPY/AgRP mRNA的表达水平明显高于盐水对照组NPY/AgRP mRNA的表达水平(t=2.79～9.12,P<0.05,0.01),其中NPY mRNA的表达水平比盐水对照组分别增高238.09%,648.84%和156.82%,而AgRP mRNA的表达水平比盐水对照组分别增高161.45%,576.82%和121.30%。Ghrelin注射后2h NPY/AgRP mRNA的表达水平明显高于1h及3h组的表达水平(F=16.55,10.45；q=5.28～7.46,P<0.05,0.01),但1h组与3h组下丘脑弓状核NPY/AgRP mRNA的表达水平无明显差异(q=0.56,1.04；P>0.05)。免疫组化染色发现,Ghrelin注射后1h、2h、3h下丘脑弓状核NPY免疫阳性神经元的数量及平均光密度分别高于盐水对照组(1h、3h,P<0.05；2 h,P<0.01),2h分别达到最高值,而1h与3h间NPY免疫阳性神经元的数量及平均光密度均无明显差异。结论1. Ghrelin可作用于脑干DVC的GHS-R,通过上行纤维引起下丘脑弓状核NPY/AgRP mRNA的表达增加2.下丘脑弓状核NPY/AgRP神经元的激活参与了脑干尾部Ghrelin诱发的多食反应的调控。