丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要蛋白水解酶，它们不仅在消化、免疫和凝血系统方面扮演重要角色，在胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成和病原入侵等过程中也发挥重要作用。丝氨酸蛋白酶过度水解作用对机体产生损害，因而它们的酶解活性需要精确的控制。丝氨酸蛋白酶抑制剂能与丝氨酸蛋白酶形成共价或者非共价的复合物，与体内参与各种调控作用的丝氨酸蛋白酶相互制约，形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动。　　本论文由三部分组成:第一部分是肝细胞生长因子激活物抑制剂1（HAI-1）的结构生物学研究;第二部分是丝氨酸蛋白酶matriptase的酶原激活和酶活抑制机理的研究;第三部分PAI-1抑制剂设计及其溶栓机理的研究。　　HAI-1是一个多结构域的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，由N-端结构域（N-terminal domain，MANEC），内部结构域（internal domain，I），Kunitz1结构域(Kunitz domain1，K1)，LDLRA结构域(low-density lipoprotein receptor A module(LDLRA)domain，L)和Kunitz2结构域(Kunitz domain2，K2)组成。HAI-1能抑制matriptase、HGFA等丝氨酸蛋白酶的活性，在组织发育、损伤修复、肿瘤浸润和转移中发挥重要作用。HAI-1在体内存在不同形式的截短体，它们对matnptase的抑制活性存在差异。其中胞外全长HAI-1对目的蛋白酶的抑制能力比其他截短片段弱，推测HAI-1存在自我抑制现象，但是这种自我抑制的机制并不清楚。本论文运用X-射线衍射法和小角散射法对HAI-1单体以及HAI-1与matriptase的复合物进行了结构生物学研究。我们利用果蝇胚胎细胞(S2)表达系统，表达HAI-1不同长度的截短体蛋白，并得到了可溶性HAI-1(solubleHAI-1，sHAI-1)的晶体结构数据以及sHAI-1与matriptase催化结构域复合物的小角散射数据。对sHAI-1晶体结构的解析，我们发现sHAI-1处于自我抑制的构象，MANEC结构域和连接LDLRA与K2的连接区(365-linker)不仅维持了sHAI-1的自我抑制构象，而且形成了K1结构域与目的蛋白结合时的空间位阻，阻碍sHAI-1对目的蛋白的抑制作用。当与matriptase结合时，sHAI-1自我抑制构象被打开，K1结构域完全暴露，并与matriptase形成稳定的非共价复合物，抑制了matriptase的丝氨酸蛋白酶活性。这项研究揭示了HAI-1通过自我抑制调控其对靶标蛋白抑制活性的机理，为抗肿瘤转移抑制剂的研究提供了一个新的途径。　　Matriptase是Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，在几乎所有的正常上皮组织中表达，在毛囊发育、免疫系统和上皮组织的发育中都起关键的作用。从N端到C端依次为:胞内结构域、跨膜结构域、SEA结构域(sea urchin sperm protein，enteropeptidase，agrin)、两个CUB结构域(sea urchin sperm protein，enteropeptidase，agrin)、四个LDLRA类似结构域(low-density lipoprotein receptor A module(LDLRA)domain，L)和丝氨酸蛋白酶结构域(serine protease domain，SPD)。matriptase催化结构域的错义突变使得matriptase的功能失调，而引发皮肤癣;matriptase与癌症的发生发展密切相关，且matriptase高表达癌症的预后很差。因而抑制matriptase的活性，可以抑制癌症的浸润和迁移。Matriptase最初是以酶原的形式表达的，经过酶切，酶原形式的matriptase被彻底激活。matripatse一经激活就与其抑制剂HAI-1形成复合物，使得matriptase的丝氨酸蛋白酶活性受到抑制，但是目前对于matriptase的酶原激活机制和酶活抑制机制尚不清楚。在前期的工作中，我们发现，matriptase在S2中的表达水平很低，而活性位点丝氨酸的突变可增加其表达量，但仍不足以被镍柱有效捕获。在本论文中，我们将uPARH47C/N259C标签与matriptase融合表达，得到了不同截短体及相应活性位点突变的蛋白。其中突变体matriptase-340-855(S805A)具有较高的表达量及均一性。为了进一步提高蛋白表达量，我们对可以表达matriptase-340-855(S805A)重组蛋白的S2细胞二次筛选，得到了高表达matriptase-340-855(S805A蛋白的S2细胞系(15mg/L)。利用ATF亲和柱对重组蛋白纯化，我们获得了大量高纯度的酶原蛋白，此酶原蛋白可被具有丝氨酸蛋白酶活性的matriptase激活，激活形式的matriptase-340-855(S805A)能与HAI-1形成稳定的非共价复合物。本项研究为matriptase酶原激活以及活性抑制机理研究奠定了基础。　　组织型纤溶酶原激活物(tPA)是参与纤溶过程的一种关键酶，它通过激活纤溶酶原为纤溶酶而发挥溶栓作用。在临床上，重组tPA已经被FDA批准为一种溶栓药物。但tPA在血液中的半衰期短，大量使用时会引起颅内出血，同时存在神经毒性等缺点。在前期工作中，本实验室利用点突变的方法，将tPA的195位的Ser突变为Ala(tPA-S195A)，这种突变体丧失了丝氨酸蛋白酶的活性，但对PAI-1具有一定的结合能力，可竞争性与体内PAI-1非共价结合，从而提高内源性tPA的浓度，达到溶栓的目的，同时又降低了出血的风险。为了增加tPA-S195A的抑制作用，我们在tPA-S195A的基础上，以增强tPA与PAI-1间的亲水或者疏水相互作用为原则，对tPA-S195A进行进一步改造，筛选到对PAI-1的抑制能力相对较强(IC50=4.2E-8M)的突变体tPA-S195A-F150E，与tPA-S195A相比其抑制能力提高了10倍。体外溶栓试验表明tPA-S195A-F150E有很好的溶栓效果:与之前发表的基于尿激酶改造的PAItrap相比，其溶栓时间缩短了1.5倍。　　我们也对PAI-1:tPA-S195A-F150E复合物晶体结构作研究，得到了一套分辨率为3.6(A)的晶体衍射数据。此复合物的结构与之前本实验室发表的PAI-1:tPA-S195A的晶体结构基本上相同，150位由疏水性的Phe突变为亲水性的Glu后，可能增强了周围氨基酸与PAI-1的亲水相互作用，而提高两者的亲和力。