胃癌是世界范围内的高发肿瘤，手术结合化学药物治疗是目前标准化的胃癌治疗方式。虽然可延长生存时间，但由于耐药，特别是多药耐药的产生，导致化疗长期效果不尽如人意。探索多药耐药机制以逆转耐药成为当前的热点之一。转录因子是一种作用广泛、调控迅速且方式多样的调控分子。在胃癌耐药的发生中发挥着重要作用。目前对转录因子的研究方法有限，寻找针对性干预转录因子的方法是阐明耐药机制的瓶颈问题。我们前期对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR及其亲本细胞系SGC7901进行了转录因子活性谱分析，获得了31个有差异表达的转录因子。我们发现，这其中有数个因子会共用一个转录因子结合位点。通常我们将这种现象称为“冗余”。这个发现提示，共用同一个转录因子结合位点的转录因子具有相似的诱导耐药功能。根据功能相似活性位点，可将其分为以下几组：AML相关因子、AP-2A、CEBP相关分子、AP-1相关分子、CUTL-1、E4BP4、FOXO相关分子、FXR相关分子、HSF相关分子、PEBP相关分子和PITX2。对这些转录因子，如果采用siRNA逐个进行阻断，不仅工作量大，而且由于同类转录因子的功能相互补偿，也难以正确认识其在耐药调控中的作用。而根据上述的共用元件分组情况，如果我们可以对这些共用元件进行操作，那就可以同时阻断功能有互补性的一组转录因子，所获得的表型也更为稳定。转录因子诱饵策略就可以达到这种目的。转录因子诱饵策略（transcriptional factor decoy strategy, TFD strategy）是一种将外源性转录因子结合位点序列导入细胞内、竞争性封闭相关转录因子活性的策略。TFD策略亦有缺陷，最明显的是其功能分子ODN（oligo-deoxynucleotide）的细胞核转移效率过低。目前的解决方案有抗溶酶体降解、核定位信号肽交联等，但各有利弊，难以广泛使用。在对经典的shRNA表达过程的回顾中我们发现，其在细胞内有一个表达双链RNA的过程。我们猜想，具有和转录因子结合位点相似序列（T>U）的双链RNA是否也具有相应的转录因子封闭功能？如果猜想正确，不仅可以极大地降低成本，而且可以通过包装病毒来提高功能分子的细胞核转移效率。在前期研究中我们已经证实，由普通siRNA载体表达的上述种类双链RNA确实具有预期的转录因子封闭功能，并初步探讨了其发挥作用的可能机制。但尚未获得该类型双链RNA与转录因子蛋白直接相互作用的证据，其作用特异性及其在胃癌细胞中是否具有相似的功能尚不清楚。本课题将就此展开研究，并希望将其应用于胃癌耐药相关转录因子的验证中。【目的】1.利用EMSA试验以获取更为直接的新型RNA结合转录因子的证据；2.明确新型双链RNA转录因子封闭功能的特异性；3.在胃癌细胞系中对结果进行验证；4.以该新型双链RNA为工具对胃癌耐药相关因子进行验证。【方法】1.直接证据的获得。提取HEK293核蛋白，EMSA试验检测新型RNA是否能够直接结合转录因子NFκB。2.特异性验证。根据前期研究，利用已经构建完成的针对转录因子NFκB的目的载体及阳性和阴性对照，分别转染HEK293细胞，做全基因组表达谱分析。检测目的载体的转录因子封闭功能的特异性。3.目的载体在胃癌细胞系中的功能验证。在胃癌细胞系SGC7901及MKN45中对目的载体的功能进行进一步验证。4.利用VB-ODN表达的新型双链RNA对胃癌阿霉素敏感性相关转录因子进行验证，观察不同VB-ODN对胃癌细胞系敏感性的影响，并检测转染后细胞内耐药经典基因MDR1和MRP1表达以明确VB-ODN影响胃癌细胞敏感性的可能机理。【结果】1. EMSA结果证实，针对目的载体表达的序列所设计的探针能够与NFκB蛋白直接结合。直接地证实了目的载体发挥封闭功能并非类似于siRNA，而.芯片结果显示，目的载体转染并细胞内表达所造成的基因表达变化中包括了NFκB所参与的细胞增殖、凋亡、微管形成等功能，所涉及的信号通路也多涉及NFκB。对变化较为明显的基因序列进行启动子分析，发现多数基因的调控区具有NFκB的转录因子结合位点。初步说明目的载体所产生的封闭作用具有一定的特异性。3.新型RNA转染后SGC7901和MKN45细胞增殖降低，凋亡增加。PCR结果显示两种细胞中NFκB的表达未发生改变，而其下游分子表达下调。说明新型RNA对胃癌细胞同样具有类似的转录因子封闭功能。4.针对于胃癌耐药相关转录因子共用元件的新型双链RNA分别转染SGC7901和SGC7901/ADR细胞系，并用阿霉素进行处理，初步筛选出逆转耐药效果最强的VB-ODN为VB-ODN4，针对的是AP-1相关分子；诱导耐药效果最强的是VB-ODN1针对的是AML相关分子。检测了各VB-ODN转染的细胞内经典耐药基因MDR1和MRP1的表达，并与既往文献比对，获得较为一致的结果。【结论】本课题对前期构建的由siRNA表达载体表达的、具有与转录因子结合序列相似序列（T>U）的双链RNA对相应转录因子的封闭作用进行了进一步的机制探索，提供了更为直接的证据；初步检测了该作用的特异性；在胃癌细胞系中对这种作用进行了验证，并利用该类RNA工具对胃癌阿霉素敏感性相关转录因子进行了初步验证。这些发现有助于提高对转录因子作用方式的认识，所提出的VB-ODN4则具有成为耐药逆转靶点的潜力。