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家族性高胆固醇血症(FH)是一种严重的常染色体显性单基因遗传性疾病,患者临床表现明显,血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL—c)水平升高,皮肤黄色瘤,眼球角膜环,早发冠心病。纯合子患者症状严重,血浆胆固醇多高于15.54mmol/L,多在20岁时就出现严重的As和冠心病的临床症状和体征,甚至在青少年时期就可能病死于早发冠心病。加强对FH的研究对于患者早期诊断、优生优育至关重要。
[目的]
本实验以4例携带低密度脂蛋白受体(LDLR)不同类型纯合突变的FH患者为研究对象,以LDLR为切入点,研究各突变对细胞LDLR蛋白表达、结合及内化功能的影响；进而研究突变对mRNA水平的影响,并用生物信息学方法预测突变基因导致的蛋白结构的改变；分析比较不同类型LDLR基因突变的致病机制；为FH的早期诊断提供依据。
[方法]
1、根据陈在嘉主编《临床冠心病学》中我国FH临床诊断标准和意大利FH纯合子诊断标准,以及 FH患者的基因诊断标准从本实验室收集的50例纯合FH患者中选取4例LDLR基因不同类型纯合突变的患者为研究对象,进行临床资料,血脂检测、超声心动及心电图等资料的收集,进行不同类型LDLR纯合突变的临床表型的比较。
2、双色荧光流式细胞术检测永生化淋巴细胞表面荧光抗体标记LDLR的表达量,检测DiL标记的LDL与淋巴细胞膜表面LDLR结合、内化的数量,以正常人为参照,反应患者淋巴细胞表面LDLR的功能。
3、采用EBV转化外周血淋巴细胞,同时用环孢菌素A抑制T淋巴细胞的技术建立患者永生化淋巴细胞株。提取淋巴细胞中RNA并反转录为cDNA,针对各突变设计相应引物,以正常RNA做对照,实时定量PCR(RT-PCR)反应优化最佳退火温度,检测LDLR mRNA表达情况。
4、将4例FH患者突变核酸序列转换为氨基酸序列,以该序列为模板,使用SWISS-MODEL服务器预测突变LDLR蛋白的三级结构并与野生型进行比较。
[结果]
1、4例均为纯合突变,分别是大片段序列插入ins23 at493,基因缺失del ACT at632,碱基置换G>A at1448,剪接突变G>A at313+1。入选4例患者均符合FH纯合子临床诊断,皮肤多部位黄色瘤,血清胆固醇水平大幅增高(15.46～28.75 mmol/L),颈总动脉IMT在0.13cm到0.30cm之间,超声心动图可见左室增大,二尖瓣轻度返流,冠状动脉血流储备能力降低(1.26～1.73)。
2、4例FH患者永生化淋巴细胞经流式细胞术检测LDLR表达量均小于50％(3.2～45.6％)； LDLR结合功能呈不同程度低下,为正常人的23.9～73.O％；LDLR的内化功能未见低下,为正常人的55.7～90.0％。P1患者LDLR表达量最少、结合功能严重低下,分别为正常人的3.2％和23.9％。
3、成功建立FH患者永生化淋巴细胞株。RT-PCR检测到ins23 at493、del ACTat632、G>A at1448三种突变导致LDLR mRNA水平明显低于正常对照,剪接突变G>A at313+1造成LDLR第3内含子被转录,第3外显子被剪切而无表达。
4、生物信息学发现四种突变LDLR蛋白的三级结构与野生型明显不同,ins23 at493突变编码蛋白配体结合域缺失一个α螺旋和多个转角结构,三级结构整体松散；突变del ACT at632造成LDLR配体结合域转角的改变和3’端编码氨基酸的缩短；突变W462X的编码蛋白缺失两个β折叠,EGF前体结构域较正常缩短；原子非局部环境评估突变ins23 at493和G>A at1448的局部氨基酸能量高于正常,稳定性下降。
5、携带第493位碱基大片段插入突变患者LDLR表达量最少、结合功能障碍,三级结构整体松散,患者临床表型最为严重。
[结论]
1、入选4例患者全部符合FH纯合子的临床诊断及LDLR基因纯合突变,大片段序列插入ins23 at493,基因缺失del ACT at632,碱基置换W462X,剪接突变G>A at313+1。
2、4种LDLR突变类型均通过影响细胞LDLR表达量、对LDL的结合功能而导致胆固醇增高,为致病性突变。
3、LDLR基因内含子剪接突变导致外显子被剪切而致病,外显子突变均导致LDLR mRNA的水平不同程度降低。
4、LDLR蛋白三级结构的不规律改变可能是导致FH患者LDLR功能缺失的结构基础。
5、携带LDLR基因突变对编码蛋白结构影响越大患者临床表型越严重。