年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)是导致发达国家以及我国发达地区50岁以上老年人群视力丧失甚至失明的一种退行性疾病。疾病过程中涉及的主要结构有感光细胞,视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE),Bruch 膜和脉络膜毛细血管(Choroidal Neovascularization,CNV)等。早期AMD主要表现为玻璃膜疣(drusen)和RPE色素异常,晚期AMD表现为RPE和光感受器地图状萎缩(Geographic Atrophy,GA)以及CNV形成。AMD的病因非常复杂,现认为该病是由多种因素引起的综合病征,可能与年龄、遗传、种族、慢性光损伤、营养缺乏、吸烟等因素有关,但其确切的病因尚不清楚。AMD损伤人视觉最重要、最敏锐的黄斑部,造成不可逆的视力丧失,导致许多老年人在退休年龄时失去独立性,不仅影响患者的生活质量,更给国家带来一系列的社会和经济问题。近年来,抗氧化剂和矿物质补充剂等药物被用于预防AMD的发生或减缓干性AMD的进展,但是疗效并不十分理想;而对于湿性AMD,抗血管内皮生长因子(Vascular Endothelium Growth Factor,VEGF)药物治疗可有效挽救部分患者的视力,然而反复注射会增加患者的经济负担及治疗风险,而且对部分患者的治疗效果不佳。因此,寻找新的更安全有效的治疗方法和治疗靶点成为近年来眼科研究的重点课题之一。近几年大量研究表明,组织因子(tissue factor,TF)可能参与AMD的发病机制,研究者认为氧化应激反应及炎症反应可引起TF表达上调,从而诱发AMD的发生。此外,有实验数据显示TF不仅参与肿瘤血管的形成,而且参与CNV的形成。组织因子靶向肽(Tissue Factor Targeting Peptide,TF-TP)是课题组成员饶教授合成的一种新型TF靶向性小分子多肽,本研究拟探讨TF-TP对AMD可能的应用价值。围绕这一目的,我们开展了两方面的研究工作:第一部分探讨TF-TP对蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞(Human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)损伤的作用及相关机制;第二部分观察TF-TP对激光诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管的作用。目的:1.探讨TF-TP对蓝光诱导hRPE细胞损伤的作用及相关机制。2.观察TF-TP对激光诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管的作用。方法:1.首先用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP 培养正常 hRPE细胞24h后,采用CCK-8法检测不同浓度TF-TP对正常hRPE细胞有无毒副作用。2.体外培养hRPE细胞分为3组,空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐射强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组细胞先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h。运用CCK-8法检测TF-TP作用于蓝光损伤hRPE细胞的最佳浓度。并将此最佳浓度用于后面实验的分组:空白对照组、蓝光照射组和最佳浓度TF-TP组。3.分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察各组hRPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;并用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bc1-2的表达。4.采用Western blot法检测不同蓝光照射时间(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE细胞中TF蛋白的表达变化;5.利用532nm激光建立小鼠CNV模型,实验分组如下:正常对照组小鼠不做任何处理,激光组为单纯激光诱导小鼠CNV形成,给药组为激光后第一天即给予玻璃体腔注射TF-TP,隔天注射一次,共三次。并运用眼底荧光血管造影(FFA)检查评价各组小鼠CNV渗漏情况。6.采用组织病理学方法观察激光后14天各组小鼠CNV中央最大厚度;采用免疫组化染色法测定视网膜脉络膜组织中CD34的表达量;7.运用Western Blot法检测小鼠RPE-脉络膜复合物中TF蛋白的表达情况。8.统计学方法:采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析。本研究各检测指标的数据资料经W检验呈正态分布,以x±s表示。各检测指标的均数经Levene检验方差齐。两组测量指标间的差异比较采用独立样本t检验,多组测量指标间的总体差异比较均采用单因素方差分析(ANOVA),各组间多重比较均采用LSD-t检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。结果:1.不同浓度TF-TP干预正常hRPE细胞24h后,各组间细胞存活率无明显改变(F=2.15,P=0.11),提示TF-TP对hRPE细胞无毒副作用。2.空白对照组、蓝光照射组和各浓度TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)%、(43.79±6.55)%、(57.24±7.89)%、(59.97±4.73)%、(63.45±3.57)%、(58.88±5.59)%和(55.95±2.80)%。各组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义(F=9.16,P=0.00),与蓝光照射组相比,各浓度TF-TP组细胞存活率均明显升高,差异均有统计学意义(P=0.01、0.00、0.00、0.00、0.00)。150μmol/L TF-TP 组细胞的存活率最高,可作为构建TF-TP保护模型,进行后续实验。3.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而TF-TP组细胞异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻。空白对照组、蓝光照射组和150μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)%、(9.98±0.82)%和(5.73±0.88)%,组间总体比较差异有统计学差异(F206.18,P=0.00),其中TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的表达量明显增加,bcl-2蛋白的表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与蓝光损伤组相比,TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P﹤0.05)。4.不同蓝光照射时间(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE细胞中TF蛋白的相对表达量分别为(0.25±0.01)、(0.26±0.02)、(0.28±0.02)、(0.31±0.02)、(0.60±0.03)、(0.79±0.04)和(0.56±0.03)。各组间 TF 蛋白的相对表达量总体间有统计学差异(F=276.99,P﹤0.05),且TF蛋白在hRPE细胞中的表达随着蓝光照射时间的延长逐渐增加,在蓝光照射12h时达到高峰,随后出现下降。5.正常对照组小鼠的FFA检查显示:小鼠视网膜血管充盈并以视盘为中心呈放射状分布,脉络膜血管表现为弥漫性背景荧光,无荧光素渗漏。激光组小鼠在光凝后14天,FFA检查示:视网膜光斑处可见明显荧光渗漏点,造影晚期呈弥漫性荧光扩散。TF-TP给药组小鼠的FFA检查显示:视网膜光斑处可见轻度荧光渗漏,造影晚期可见渗漏和高荧光点但无明显扩散。激光组和TF-TP给药组两组间渗漏率差异无统计学差异(X2=0.59,P=0.24)。6.与激光组的CNV厚度(115.89±5.04um,n=6)相比,TF-TP给药组的CNV厚度(60.02±2.48um,n=6)明显减小,两者间具有统计学差异(t=24.39,P<0.05),提示TF-TP干预后可以显著抑制CNV的厚度。免疫组化结果显示:TF-TP给药组的CD34免疫组化阳性反应物平均光密度值(0.09±0.03)与单纯激光组(0.16±0.01)相比明显减小,两者间差异具有统计学意义(t=3.93,P<0.05)。7.Western Blot结果显示:正常对照组、激光组、TF-TP给药组的TF蛋白的相对表达量分别为(0.14±0.01)、(0.40±0.02)、(0.22±0.03),经过单因素方差分析可得,各组间TF蛋白的相对表达量总体间有统计学差异(F=128.26,P<0.05),各组间进一步多重比较,TF-TP给药组的TF蛋白相对表达量与激光组比较明显降低,两组间差异具有统计学意义(P﹤0.05)。结论:1.TF-TP能够改善蓝光诱导损伤的hRPE细胞结构,降低细胞凋亡率,减少细胞中TF蛋白和bax蛋白的表达,增加bcl-2蛋白的表达,减轻蓝光诱导的hRPE细胞损伤。2.TF-TP可以减小激光诱导的小鼠CNV厚度,降低CD34的阳性表达,减少小鼠RPE脉络膜混合物中TF蛋白的表达,抑制小鼠CNV的形成。