目的:病理条件下,中、高浓度的活性氧(ROS)通过细胞氧化应激反应可以诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。ROS与细胞信号转导之间也存在内在关联。有实验研究表明小鼠角膜碱烧伤后,NADPH氧化酶4(NOX4)表达增加,促进了小鼠角膜新生血管的形成。我们知道,ROS可以来源于NOX4。有研究表明,小鼠角膜碱烧伤后ROS调控炎性小体,导致NLRP3和NLRP6这两种炎性小体表达失衡,进而促进细胞因子的表达。本实验拟研究小鼠角膜碱烧伤条件下ROS调控的NLRP3和NLRP6这两种炎性小体与角膜新生血管的关系。AIP1(ASK1-interacting protein-1)是Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白(Ras-GAP)家族的新成员。近年来研究表明,AIP1不仅能作为肿瘤抑制基因抑制肿瘤发生发展,还能通过多种信号通路参与炎性诱导的新生血管。本实验进一步全面研究AIP1在角膜新生血管中的调节功能。本实验研究角膜碱烧伤模型中的AIP1、ROS、炎性小体的变化机制及其相互作用机制。方法:用1N Na OH溶液浸泡直径为2mm的Whatman滤纸,对小鼠右眼角膜进行碱烧伤处理。碱烧伤后4个不同时间点(3天、7天、10天、14天后)进行裂隙灯拍照,取材。碱烧伤后分别用10μM的NOX4抑制剂GLX351322或10μM的DMSO溶液点眼,每天4次连续10天。10天后裂隙灯拍照,取材。对AIP1基因敲除小鼠和野生型小鼠的右眼角膜分别进行碱烧伤操作,10天后裂隙灯拍照,取材。用微量注射器将腺病毒编码的AIP1-GFP(green fluorescent protein)或GFP(2.54×?10~8PFU)注入小鼠右眼前房,待两天角膜愈合后进行碱烧伤操作。10天后裂隙灯拍照,取材。使用裂隙灯拍照记录活体小鼠角膜新生血管状态。使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(Western-Blot)检测AIP1、NOX4、NLRP3、NLRP6及其相关的炎症因子及新生血管相关蛋白。使用DCFDA染色检测在小鼠角膜碱烧伤处理后ROS产生的量,以评估不同处理条件下的小鼠角膜氧化应激状态。使用角膜组织铺片来观察角膜新生血管生成的变化。结果:在角膜碱烧伤小鼠模型中,NLRP3/NLRP6表达失衡,NLRP3表达增加,NLRP6表达下降,同时Clv-casp-1,ASC,Clv-IL-1β和新生血管相关蛋白VEGFA表达增高。在角膜碱烧伤小鼠模型中,NOX4的抑制剂GLX351322滴眼液可以通过减少ROS的表达来逆转NLRP3/NLRP6的失衡,同时降低Clv-casp-1,ASC,Clv-IL-1β,并降低新生血管相关蛋白VEGFA的表达,从而减少新生血管的形成。NOX4的激活是由于AIP1在碱烧伤小鼠的角膜中的表达减少所致。小鼠角膜碱烧伤后,与对照组相比,AIP1基因敲除小鼠的NOX4表达增加,并且NLRP3/NLRP6表达失衡加重,角膜的新生血管生产明显增多。小鼠前房内注入过表达的AIP1病毒可以逆转这一现象。小鼠角膜碱烧伤后,与对照组相比,AIP1前房过表达小鼠角膜的NOX4的表达下降,ROS表达减少,NLRP3/NLRP6表达失衡被逆转,并且新生血管的生成明显减少。结论:AIP1/NOX4/NLRP3、NLRP6炎症小体可以直接调控碱烧伤后的角膜炎症和角膜新生血管。基于我们发现的碱烧伤条件下角膜新生血管的发病机制,有望为患者提供新的治疗策略。