基于单色荧光“off-on”系统高灵敏检测肿瘤标志物特异性dsDNA的研究

来源 :北京理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:suilong12341106
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肿瘤是严重危害人类健康和生命的一种疾病,血液游离DNA在肿瘤发生的早期就可出现含量上升的现象,且在肿瘤患者血液中游离DNA还存在微卫星变化、癌基因,抑癌基因突变、超甲基化及表观遗传学的改变,同时由于血液样本较肿瘤活组织检查相对容易获取、无创伤、操作简便易行且可用于人群大规模筛查等,使游离DNA作为一种新颖的肿瘤标志物越来越受到研究人员的重视,建立和发展快速高灵敏的DNA检测方法具有重要的生物医学意义。本论文利用了一种基于单色荧光“off-on”开关系统的方法实现高灵敏特异性检测血液中游离的dsDNA。首先制备发射波长在605 nm、谷胱甘肽包被的水溶性CdTe量子点(GSH-CdTe QDs),并对该量子点进行表征。CdTe量子点呈颗粒状,粒径均匀并且具有很好的分散性,粒径约为2.63 nm,荧光量子产率达41.8%。利用钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(phen)2dppz]2+对CdTe量子点的静电猝灭作用,组成荧光”off-on”开关系统,并且当[Ru(phen)2(dppz)]2+的浓度:CdTe量子点的浓度为100:1时,可以完全猝灭CdTe量子点的荧光。当向这个体系中加入dsDNA后,随着dsDNA浓度的逐渐增加,系统的荧光逐渐增加,可以实现对于dsDNA的高灵敏检测,检测限为0.06 ng/ml。本文为了实现高灵敏特异性检测肿瘤,对单色荧光“off-on”开关系统检测dsDNA的特异性进行了考察。根据文献设计了一段肺癌易感染基因片段的短单链,选用NaOH,EDTA,尿素作为变性剂探索出一个合适的变性剂以及该变性剂浓度,以实现将正常人血液中的dsDNA变性成为长单链后,所设计的短单链可以与在正常人血液中的长单链完全结合,而两个长双链之间不互相结合的效果。最终确定选用9mol/L尿素作为变性剂。并利用具有上述特性的单色荧光“off-on”开关系统应用于尿液的检测,实验结果显示尿液样品中DNA含量极低,不适于单色荧光“off-on”开关系统检测。利用上述系统应用于30例临床血清样本的检测,在灵敏度方面的检测结果与医院结果对比阳性率为50%,在特异性方面的检测结果与医院结果对比阳性率为30%,与EGFR基因出现的突变概率相符,阴性对照中未发现有特异性突变现象的存在。
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