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二羟基丙酮作为最简单的酮糖是一种重要的精细化工产品,其独特的化学结构,广泛参与诸如聚合,缩合等各种化学反应,是一个重要的化学合成中间体和多功能试剂。利用Gluconobacteroxydans的不完全代谢特性,可以直接将甘油脱氢生成二羟基丙酮。针对国内目前在这方面的研究基本处于空白的现状,本论文基于本实验室所保藏的一株Gluconobacteroxydans,比较系统地研究了整个生物转化到最终产品分离提纯和结晶的全过程,为其能够实现产业化打下基础。
二羟基丙酮既能以生长细胞发酵法转化甘油生成,也能够以静息细胞或固定化细胞转化的方式生成。作者首先研究了以生长细胞发酵法转化甘油生成二羟基丙酮的过程,发酵培养基的最适成分是:甘油8﹪,酵母粉2.0﹪,磷酸二氢钾0.1﹪,七水硫酸镁0.05﹪。这种较为简单的培养基适于工业化的扩大生产。通过40个小时的发酵,二羟基丙酮最终的含量为70.5g/l,甘油到二羟基丙酮的转化率可以达到90﹪。在双阶段培养的模式下,解除了细胞生长和产物的抑制作用,经过60个小时左右的发酵,在甘油浓度120g/l的情况下,可以获得106.5g/l的二羟基丙酮,相比较单一的甘油发酵的90.3g/l,转化率提高了13.7﹪,发酵时间也缩短了10个小时。
针对已有的固定化Gluconobacteroxydans方法的不足,利用聚乙烯醇—海藻酸钠作为载体材料固定菌体,实现了转化过程的连续性和稳定性。固定化的条件为:聚乙烯醇的最佳质量分数为8﹪,海藻酸钠为0.8﹪;最适包埋量为每毫升凝胶0.25g湿细胞。固定化细胞的热稳定性、对酸碱的抗性以及储存的稳定性均较游离细胞均有所提高。所得到的胶体颗粒具有耐剪切力,稳定性高的特点。利用其作为催化剂在机械搅拌式反应器中进行转化,在甘油浓度60g/l的情况下,首批转化率达到97.6﹪,并且可以实现连续转化5个批次,平均转化率在86﹪以上。
从工业化生产的角度出发,研究了Gluconobacteroxydans菌体的低成本培养,以廉价的玉米糖化液和玉米浆代替常规的山梨醇和酵母粉培养基进行菌体的培养。在糖浓度80g/l,玉米浆浓度25g/l,添加10g/l甘油做诱导剂的情况下,其菌体量和酶活分别达到4.2g/l和5.23U/ml,实现了Gluconobacteroxydans的工业化培养。在利用静息细胞转化过程中,70g/l的甘油溶液经过26个小时左右的反应,生成65.3g/l的二羟基丙酮,转化率达到95﹪以上。通过补料分批转化,可以进一步的提高产量,最终的二羟基丙酮含量可以达到81.5g/l。通过低成本培养和静息细胞转化的联合运用,建立了一种更加简单、高效的生产方式。
从动力学的角度研究了Gluconobacteroxydans分批发酵转化甘油生成二羟基丙酮的情况。通过动力学方程的推导,分别得出了适合描述菌体生长、产物生成和底物消耗的动力学模型。将二羟基丙酮作为一个单独的成分,考察了它对于菌体的生理生化的作用。发现较低的二羟基丙酮浓度下,对细胞生长的影响不显著,而在较高的浓度下,所受的抑制作用比较明显。在二羟基丙酮的浓度超过100g/l时,几乎没有菌体的生长。
生化产品的分离和提纯是生物化工工业的核心,直接决定了产品的质量。针对二羟基丙酮分离和提纯方面研究报道基本空白的情况,作者摸索了这方面的工作,较详细地给出了整个分离提纯的全流程,考察了二羟基丙酮在不同溶剂条件下的溶解度曲线。利用90﹪的乙醇溶液作为溶剂对二羟基丙酮浓缩液进行结晶,在4℃的情况下可以得到纯度为99﹪的晶体,结晶收率在66﹪以上。
利用生物法转化甘油制备二羟基丙酮具有现实的社会效益和经济效益。一方面可以弥补国内在这方面生产的空白。另一方面,我国目前正在开展研制生物柴油作为新的能源产品的工作。生物柴油的生产中,会产生大量的副产物—甘油。可以预见,在不远的将来随着生物能源领域的不断发展,如何提高来自生物质能源与来自矿物质能源的竞争能力,是关系到生物质能源能否广泛运用的关键。利用甘油制备二羟基丙酮可以更好地开发甘油的用途,提高产品的附加值,对于整个生物能源的发展及催化研究具有实际的意义。