多年来,很多学者已经致力于研究抗菌肽,取得的成果也比较多,不仅发现了抗菌活性,还公布了部分氨基酸序列,Tomita等学者从经蛋白酶降解后的牛乳铁蛋白的产物中发现了活性多肽的抑菌性能;Evan F.Haney等人从牛乳铁蛋白的N端发现了一种新的阳离子抗菌肽序列,被称为lactoferrampin(Lf);由于卵转铁蛋白(OVT)与乳铁蛋白(LF)为同一性质的蛋白,因此,OVT经合适的蛋白酶酶解后,也可得到具有抗菌活性的肽段。目前研究的从卵转铁蛋白中分离得到的抗菌肽就是Hisham R. Ibrahim等人通过酶解获得的,得到了由92个氨基酸残基组成的肽段。本文研究的主要内容是:(1)胃蛋白酶酶解卵转铁蛋白制备抗菌活性肽最佳酶解条件是:在温度40℃条件下,pH值为2.0,底物浓度为4%,酶的加入量为1%,水解时间为2h,其抑菌活性最好;通过正交实验的方差分析可知,底物浓度、pH值对实验结果的显著性均为0.05,酶与底物浓度比对实验结果的显著性为0.1,时间对实验结果的影响不显著;胰蛋白酶酶解卵转铁蛋白制备抗菌活性肽的实验研究,考察了底物浓度、pH值,酶解时间、温度四个因素的变化对酶解实验的影响,结果得到:胰蛋白酶水解得到的肽段抑菌活性不明显,有些条件下,没有活性;双酶水解卵转铁蛋白制备抗菌活性肽的实验研究表明,经胃蛋白酶酶解后,利用胰蛋白酶二次水解并不能提高抑菌活性,甚至有的条件会使活性降低,所以,胰蛋白酶单酶水解及双酶水解的方法对于本文从卵转铁蛋白中制备抗菌活性肽不合适。(2)利用高效液相色谱法,使用TSK凝胶色谱柱,测定了经胃蛋白酶酶解后的卵转铁蛋白抗菌活性肽混合物的分子量范围,标准品杆菌肽、牛胰岛素、细胞色素C的出峰时间分别为19.990min、17.669min、14.000min,根据分子量与保留时间的关系得到了回归方程:Y=-0.1354X+6.0129,R2=0.9941;通过回归方程计算,经胃蛋白酶酶解卵转铁蛋白得到的抗菌活性肽混合物,并通过超滤膜初步分离后分子量范围大约在2300-9000 Da左右;本文主要研究分子量范围在2300-4800 Da大小的肽段,对其进行分离纯化,研究抑菌活性。(3)对卵转铁蛋白抗菌活性肽混合物的分离纯化采用柱层析的方法,利用SephadexG-50,通过考察以蒸馏水和不同浓度的NaCl作为流动相,及分离过程中的上样浓度和上样量的不同对分离效果的影响,实验得到了最佳纯化条件是:以蒸馏水作为流动相,在220nm波长下,流速为1.5mL/min,上样浓度为0.2 g/mL,上样量为0.2mL时,对样品的分离效果最好,并将样品分离出三个单峰。(4)利用HPLC测定经Sephadex G-50分离纯化出的三个组分的分子量范围,标准品杆菌肽、牛胰岛素、细胞色素C的出峰时间分别在20.178min、15.796min和13.056min,其标准曲线回归方程为:Y=-0.1327X+5.8333,R2=0.9989;通过方程计算得到了三个峰的分子量范围;抑菌活性研究说明,分离纯化出的卵转铁蛋白抗菌活性肽具有抗G-和G+的活性,并对G+更敏感;且峰1具有较好的抗菌活性,高于峰2、峰3;通过高效液相图谱分析可知,其分子量大小约为3015 Da,纯度较高;氨基酸组成分析表明,纯化后的峰1带有正电荷,具有阳离子性质,符合抗菌肽的性质;对峰1进行的稳定性实验研究得到,其具有较好的热稳定性,对于pH值在1-10的范围内都有良好的适应性,仍具有很好的抑菌活性;在100℃的沸水中加热30min,其活性只稍微减弱;反复冻融数次后活性未减弱;卵转铁蛋白抗菌活性肽对E.coli的MIC为:100μg/mL;对S. aureus的MIC为:60μg/mL。对抗菌活性肽的研究已成为近年来的热点之一,而对以从鸡蛋中提取的卵转铁蛋白为原料,制备抗菌活性肽的研究很少;本研究利用酶解技术,用柱层析方法对其分离纯化,筛选出新的具有抗菌活性的肽段,为蛋清蛋白的综合开发和利用提供了依据,为该产品在食品和药品领域的进一步应用奠定基础。