miRNA-106b-5p对癫痫持续状态小鼠海马小胶质细胞激活极化的影响及机制研究

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目的:癫痫是儿童最常见的神经系统疾病之一,其发病机制尚不完全清楚。目前认为癫痫的发生与遗传、代谢、免疫、炎症等多种因素相关。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞及促炎细胞因子的主要产生者,在癫痫发生中发挥着重要的作用。既往已有研究证明,颞叶癫痫患者及动物模型海马组织中存在大量激活的小胶质细胞。激活后的小胶质细胞分泌促炎细胞因子可导致神经元兴奋性升高并直接损伤神经元,被认为是癫痫发生的主要驱动因素之一;而小胶质细胞的非炎症作用,如吞噬作用、突触修剪及重塑等,也被认为参与了癫痫发生的过程。miRNA是一种重要的基因调控分子,可在转录后水平调控整个基因网络。目前已有研究发现癫痫患者的外周血中miR-106b-5p表达明显升高,且与癫痫发作的严重程度正相关,并推测其升高是癫痫患者脑内慢性炎症的反应。因此,我们研究的目的是在匹罗卡品诱导的癫痫持续状态(SE)模型中,观察小鼠海马内miR-106b-5p及其靶基因RGMa和小胶质细胞表型标记物及相关细胞因子的表达变化,分析其中可能存在的联系,进而在后续的动物及细胞实验中,利用慢病毒下调miR-106b-5p的表达,确认其对小胶质细胞表型及相关细胞因子表达的影响,并探讨其可能机制及对癫痫发生的潜在影响。方法:本研究包含动物实验两部分和细胞实验一部分。1、C57BL/6小鼠随机分为对照组和癫痫组,其中癫痫组进一步分为6h、1d、3d、7d、14d、21d共6个时间点。采用匹罗卡品腹腔注射建立小鼠SE模型。HE及TUNEL染色观察小鼠海马神经元损伤情况;RT-q PCR或Western blot技术检测小鼠海马内miR-106b-5p,RGMa,M1和M2型小胶质细胞标志物i NOS和Arg-1及相关细胞因子IL-1β、IL-6和IL-4、IL-10,以及髓系细胞触发受体2(TREM2)的表达情况;荧光原位杂交-免疫荧光染色和免疫荧光双重染色定位miR-106b-5p和RGMa在小胶质细胞内表达;双荧光素酶实验验证miR-106b-5p可靶向抑制RGMa的表达。2、C57BL/6小鼠随机分为对照组及癫痫组,其中癫痫组进一步根据预处理不同分为Epilepsy组、Epilepsy+NC组、Epilepsy+inhibitor组、Epilepsy+inhibitor+shcontrol组、Epilepsy+inhibitor+sh RGMa组。小鼠造模前1周,按组别双侧海马注射无血清培养基或相应慢病毒。造模时观察小鼠癫痫发作潜伏期;造模后HE及TUNEL染色观察小鼠海马神经元损伤情况;RT-q PCR或Western blot技术检测小鼠海马内miR-106b-5p、RGMa、M1和M2型小胶质细胞标志物及相关细胞因子的表达情况;流式细胞计数M1和M2型小胶质细胞比例变化;Western blot技术检测Rac1、p-JNK、p-p38蛋白的表达情况;Brdu染色观察海马齿状回神经干细胞增殖情况;旷场试验观察小鼠行为学变化。3、采用无镁溶液诱导的HT22细胞与BV2细胞共培养体系,利用慢病毒感染下调BV2细胞内miR-106b-5p、RGMa的表达。按预处理不同,将共培养体系分为Control组、Mg-free组、Mg-free+NC组、Mg-free+inhibitor组、Mg-free+inhibitor+shcontrol组、Mg-free+inhibitor+sh RGMa组。采用RT-q PCR或Western blot技术检测BV2细胞内miR-106b-5p、RGMa、M1和M2型小胶质细胞标志物及相关细胞因子的表达情况;免疫荧光染色观察BV2细胞内RGMa、i NOS、Arg-1的表达变化;流式细胞计数M1和M2型BV2细胞比例变化;Western blot技术检测BV2细胞内Rac1、p-JNK、p-p38蛋白的表达情况;MTT及LDH释放实验检测HT22细胞的损伤情况。结果:1、HE及TUNEL染色显示,SE后6h小鼠海马即出现神经元损伤,3d时损伤最为明显,21d时有所恢复。2、与对照组相比,SE后小鼠海马内miR-106b-5p表达升高,3d达峰(P<0.05),而后下降,21d时仍未恢复正常(P<0.05);RGMa表达下降,持续至21d仍未恢复(P<0.05);M1型小胶质细胞标志物i NOS及相关细胞因子IL-1β、IL-6的表达升高,3d达峰(P<0.05),而后下降,21d时恢复正常(P>0.05);M2型小胶质细胞标志物Arg-1及相关细胞因子IL-10的表达也出现升高,3d达峰(P<0.05),而后下降,21d时仍未恢复正常(P<0.05),而IL-4的表达虽也升高,但在7d达峰(P<0.05),而后下降,21d时恢复正常(P>0.05);TREM2的表达下降,持续至21d仍未恢复(P<0.05)。3、荧光原位杂交-免疫荧光染色可见miR-106b-5p与Iba-1共表达,免疫荧光双重染色可见RGMa与Iba-1共表达。4、双荧光素酶实验证实miR-106b-5p可靶向抑制RGMa表达。5、慢病毒LV-miR-106b-5p inhibitor可下调SE后小鼠海马内miR-106b-5p的表达(P<0.05),随着miR-106b-5p表达的下降,RGMa表达升高(P<0.05),而同时注射慢病毒LV-sh RGMa,可再次下调RGMa的表达。6、慢病毒下调miR-106b-5p的表达,可延长小鼠癫痫发作潜伏期(P<0.05),减少海马神经元凋亡(P<0.05),抑制齿状回神经干细胞增殖(P<0.05),增加旷场试验中小鼠的总移动距离(P<0.05)、中心区停留时间(P<0.05)和直立次数(P<0.05),而同时使用慢病毒下调RGMa的表达,可逆转下调miR-106b-5p的效果。7、慢病毒下调miR-106b-5p的表达,使SE后小鼠海马M1型小胶质细胞标志物i NOS及相关细胞因子IL-1β、IL-6的表达下降(P<0.05),流式细胞计数比例降低(P<0.05),M2型小胶质细胞标志物Arg-1及相关细胞因子IL-4、IL-10的表达升高(P<0.05),流式细胞计数比例增加(P<0.05),而同时使用慢病毒下调RGMa的表达,逆转了下调miR-106b-5p的影响。8、慢病毒下调miR-106b-5p的表达,使SE后小鼠海马内Rac1、p-JNK、p-p38表达下降(P<0.05),TREM2表达上升(P<0.05),而同时使用慢病毒下调RGMa的表达,Rac1、p-JNK、p-p38表达再次上升,TREM2表达下降。9、无镁溶液处理的HT22细胞及相应培养液刺激的BV2细胞内miR-106b-5p的表达升高(P<0.05),RGMa的表达下降(P<0.05),与匹罗卡品诱导的SE小鼠模型表现一致。10、无镁溶液处理的HT22细胞与BV2细胞共培养体系中,慢病毒下调BV2细胞内miR-106b-5p的表达,使BV2细胞中M1型小胶质细胞标志物i NOS及相关细胞因子IL-1β、IL-6的表达下降(P<0.05),细胞比例降低(P<0.05),M2型小胶质细胞标志物Arg-1及相关细胞因子IL-4、IL-10的表达升高(P<0.05),细胞比例增加(P<0.05),而同时使用慢病毒下调RGMa的表达,逆转了下调miR-106b-5p的影响。11、慢病毒下调miR-106b-5p的表达后,BV2细胞内Rac1、p-JNK、p-p38的表达下降(P<0.05),TREM2表达上升(P<0.05),而同时使用慢病毒下调RGMa的表达,Rac1、p-JNK、p-p38的表达再次上升,TREM2表达下降。12、下调BV2细胞内miR-106b-5p的表达后,HT22细胞活性增加(P<0.05),LDH释放减少(P<0.05),同时使用慢病毒下调BV2细胞内RGMa的表达,HT22细胞活性下降,LDH释放增多。结论:1、SE后,小鼠海马内miR-106b-5p的表达变化与M1和M2型小胶质细胞表型标志物及相关细胞因子一致,并与RGMa及TREM2相反,提示miR-106b-5p可能通过靶向调节RGMa,影响了小胶质细胞的激活极化。2、匹罗卡品诱导的SE小鼠模型和无镁溶液处理的HT22细胞与BV2细胞共培养体系内,慢病毒抑制剂下调miR-106b-5p的表达,可促进小胶质细胞向M2型转化,减轻神经元损伤,并降低小鼠的癫痫易感性,减少海马齿状回神经发生,使SE后小鼠自主运动增加。3、下调miR-106b-5p的上述作用,可能是通过靶向RGMa-Rac1-JNK/p38MAPK轴来实现的。
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