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马立克氏病（Marek’s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的一种恶性T淋巴细胞瘤疾病,主要感染鸡和火鸡,能引起宿主机体的免疫抑制,从而极易导致其他病毒和细菌的混合感染,对全世界的家禽产业造成巨大经济损失。尽管目前广泛使用的CVI988疫苗能够提供较好的免疫保护力,大大降低鸡群死亡率,但仍然不能阻止MDV病毒颗粒的传播和感染,同时在疫苗免疫压力的选择下,MDV的毒力也在不断进化,在CVI988免疫保护的鸡群中,仍有MDV的感染散在发生。至今为止,MDV感染致肿瘤机制还未清晰,病毒如何通过与宿主细胞相互作用诱导肿瘤发生发展还未阐明。Wnt/β-catenin信号通路在进化过程中高度保守,普遍存在于各种动物中,是机体生长过程中的关键信号传导途径,能够控制细胞的极性、生长以及分化等等,并且涉及包括癌症、糖尿病等的多种疾病,它的异常激活与肿瘤发生发展密切相关。作为能够引起肿瘤的病毒,MDV与Wnt/β-catenin信号通路之间的相互关系研究还未见报道。本研究主要关注Wnt/β-catenin信号通路与MDV复制增殖的关系,并深入研究病毒编码蛋白对信号通路的影响,实验结果为MDV的致病与治肿瘤机制提供新的理论依据,同时为MD的防控提供新的靶点。1.MDV复制对Wnt/β-catenin信号通路的影响为了研究MDV对Wnt/β-catenin信号通路的影响,本研究从体内和体外两个方面开展了研究。在体内,使用MDV RB1B毒株感染SPF鸡后,提取病毒主要侵袭脏器（脑、法氏囊、胸腺、脾脏、肾脏和肝脏）RNA,反转录后进行荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）的检测,结果显示 Wnt/β-catenin信号通路相关因子均上调,同时随着机体内病毒感染的逐步增加,通路的相关基因表达上调愈发显著,实验结果提示MDV与Wnt/β-catenin信号通路之间具有密切联系,并且MDV感染后能够显著激活宿主体内的Wnt/β-catenin信号通路的应答。基于体内实验的结果,在体外使用MDV RB1B毒株感染鸡胚成纤维细胞（chicken embryonic fibroblasts,CEF）后,除了提取细胞RNA检测基因表达水平外,还使用激光共聚焦技术检测MDV感染CEF细胞中的β-catenin的定位情况。与体内实验结果一致,在MDV感染72h时,存在于细胞浆中的β-catenin入核,提示Wnt/β-catenin信号通路被激活,同时基因检测结果与其具有一致性。由以上实验结果表明MDV RB1B毒株感染在体内、体外均能激活Wnt/β-catenin信号通路,但MDV究竟是如何激Wnt/β-catenin信号通路活通路,以及激活通路后会对MDV的复制增殖产生什么样影响,还需进一步进行研究探索。2.Wnt/β-catenin信号通路活化状态对MDV复制增殖的影响为了研究Wnt/β-catenin信号通路对病毒复制的影响,本研究首先使用信号通路激活剂氯化锂（Lithium Chloride,LiCl）处理MDV感染的细胞,并收集细胞 RNA 和总蛋白,通过间接免疫荧光（indirect immunofluorescence,IFA）、Western blot（WB）、qRT-PCR、蚀斑计数、蚀斑面积测量等技术检测激活通路后MDV的复制增殖情况。结果显示,不论是从病毒基因表达水平、蛋白的表达水平以及蚀斑形成情况来看,LiCl激活通路后能显著抑制病毒的复制增殖,并且这种抑制效果除了具有剂量依赖性和时间依赖性以外,还作用在病毒感染的每一个环节中。同时还检测了细胞中与天然免疫和炎症相关的细胞因子,结果表明干扰素相关基因以及炎症相关基因的表达均被显著下调。同时本研究还使用了信号通路特异性抑制剂iCRT14。通过使用iCRT14处理MDV感染的CEF细胞,并收集其RNA,通过qRT-PCR以及蚀斑形成结果来看,当通路被抑制后,MDV的复制增殖被促进了。同时还设计了先使用通路激活剂LiCl处理后感染病毒,再使用iCRT14来抑制通路的实验,来研究通路激活后对MDV的抑制作用是否可逆。MDV基因的表达水平以及蚀斑形成结果表明,iCRT 14缓解了 Wnt/β-catenin信号通路激活后对MDV的抑制作用,说明Wnt/β-catenin 信号通路的激活抑制 MDV 的复制与增殖。综合以上实验结果显示,当通路被激活时对病毒的复制增殖具有抑制效果,而当通路被抑制时,对MDV的复制增殖具有促进作用。3.MDV编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响为了探索MDV如何激活Wnt/β-catenin信号通路,本研究构建了pCAGGS-Meq,pCAGGS-pp38、pCAGGS-vIL8、pCAGGS-LORF9 这 4 种病毒编码蛋白基因的克隆质粒,转染CEF与LMH细胞,并进行qRT-PCR、双荧光素酶报告实验和WB实验,检测病毒编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果显示,4种病毒编码蛋白对信号通路均具有激活作用,上调下游癌症相关基因（如c-Myc、mmp7）的表达,其中MDV的主要致瘤基因Meq和pp38对通路相关基因的表达上调最为显著。作为与肿瘤的产生与转化密切相关的基因,pp38和Meq在病毒感染宿主致肿瘤致病的过程中具有重要作用,将其转染CEF后再使用信号通路特异性抑制剂iCRT14处理细胞,结果显示,病毒编码蛋白对通路的激活作用被iCRT14所抑制,说明病毒编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用具有特异性。本研究的实验结果为阐明MDV感染致肿瘤的机制提供新的理论依据。