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研究背景和目的：结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，在全球的发生率和死亡率分别居肿瘤的第三和第四位而成为严重危害人类健康的疾病之一。目前结直肠癌的病因不确切、诊断手段存在着一定的局限性和结直肠癌的靶向治疗药物存在着种类少，副作用大，应用范围窄等缺点。早期诊断方法和治疗是决定患者治疗和预后的关键，寻找有效的解决手段，寻找有效靶标，开展特异性诊断和治疗是目前该研究的热点。
SELEX技术为目前最常用的靶物质筛选技术之一，其原理主要利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸序列，结合体外PCR扩增技术，使其得到指数级富集，循环数轮，最终进化成高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。其中细胞SELEX技术是以整个细胞作为靶标筛选特异性适配体，基于细胞的优势，通过细胞SELEX技术可筛选出多靶点的适配体、发现新的生物标记、得到可识别天然构象蛋白的适配体，为疾病特别是肿瘤的早期诊断和预后检测提供方案。适配体对癌症的诊断和治疗有着广泛的应用前景，研究包括通过化学键与纳米金、超顺磁四氧化三铁纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒、荧光染料等结合，形成靶向给药系统，用于肿瘤的检测和治疗。此外，适配体可在未知肿瘤标志物的条件下进行筛选，得到特异性适配体再通过适配体发现新的标志物。本研究的目的利用细胞SELEX技术，筛选特异性靶向结肠癌高亲和力的适配体，为结肠癌的诊断和治疗提供新的手段。
方法：利用细胞SELEX技术，以多个非肿瘤细胞系(包括人血管平滑肌细胞系HA-VSMC、人胚肺成纤维细胞HFL1、大鼠心肌细胞H9c2)作为反筛细胞，以结肠癌细胞系HCT116作为正筛细胞，筛选靶向结直肠癌细胞的适配体。在筛选过程中，首先设计为总长81个碱基的寡核苷酸DNA随机文库序列，两端分别为25个碱基的PCR上游引物序列和21个碱基的下游引物序列，中间为35个随机碱基序列。将该文库与反筛细胞孵育，去除与反筛细胞结合的序列，不结合的序列与正筛细胞孵育，去除不结合HCT116细胞的序列，通过酚氯仿抽提法提取总DNA，得到与正筛细胞结合的序列。以提取得到的DNA为模板，进行PCR扩增。对每轮PCR扩增的条件进行优化，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测PCR效率及产物的特异性得到效率高，条带单一的PCR产物。得到的PCR产物利用链霉亲和素磁珠制备单链DNA用于下一轮的筛选。
每隔五轮筛选，通过荧光共聚焦显微镜进行筛选文库与结直肠癌细胞HCT116的结合富集情况，当富集达到饱和进行克隆测序。测序结果利用软件ClustalX2进行同源性分析，挑选适配体进行二级结构分析；对筛选得到的适配体进行初步研究，利用荧光共聚焦显微镜直观观察适配体的与不同细胞(包括正筛细胞、反筛细胞、其他癌细胞)的结合情况以检测适配体的特异性。利用酶联寡聚核苷酸吸附试验方法(ELONA法)进行亲和力检测，测定适配体与HCT116细胞的解离常数Kd值。
结果：在第一轮的筛选中，通过PCR条件优化，第一次的PCR扩增的退火温度为69℃，循环数为25个循环，在该条件下，最终得到PCR产物浓度为73ng/μL,体积为120μL；第二次条件优化的PCR退火温度为69℃，循环数为12个循环，。在每轮的筛选过程中均对PCR条件进行优化，选择PCR条带单一，效率高的条件进行PCR扩增。经过15轮的筛选后，筛选文库与HCT116细胞出现明显的富集，将第十五轮筛选后的文库进行克隆测序，得到100条序列。通过ClustalX2软件分析，去除不是81个碱基的序列，得到56条序列适配体，其中1号序列有8条重复序列，2号有两条重复序列。56条序列同源性分析得到3组不同源的适配体，挑选四条适配体，取名为AptH1、AptH8、AptH9、AptH10。并通过激光共聚焦显微镜和ELONA法验证特异性和亲和力。该适配体均能能特异性靶向结肠癌细胞HCT116，其结合亲和力在8nM～22nM，其中适配体AptH8与HCT116细胞的结合Kd值为8.81±0.36nM。
结论：1.本研究通过细胞SELEX技术，利用多个非肿瘤细胞系作为反筛细胞，结直肠癌细胞系HCT116作为正筛细胞，筛选出56条靶向结直肠癌HCT116细胞的适配体，同源性分析得到3组非同源序列。
2.其中的四条适配体AptH1、AptH8、AptH9、AptH10均能特异性靶向HCT116细胞，与反筛细胞细胞几乎不结合。筛选得到的适配体能特异性靶向HCT116细胞并具有很高的亲和力，可作为进一步研究的靶分子。
SELEX技术为目前最常用的靶物质筛选技术之一，其原理主要利用大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸序列，结合体外PCR扩增技术，使其得到指数级富集，循环数轮，最终进化成高亲和力和高特异性的寡核苷酸配体。其中细胞SELEX技术是以整个细胞作为靶标筛选特异性适配体，基于细胞的优势，通过细胞SELEX技术可筛选出多靶点的适配体、发现新的生物标记、得到可识别天然构象蛋白的适配体，为疾病特别是肿瘤的早期诊断和预后检测提供方案。适配体对癌症的诊断和治疗有着广泛的应用前景，研究包括通过化学键与纳米金、超顺磁四氧化三铁纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒、荧光染料等结合，形成靶向给药系统，用于肿瘤的检测和治疗。此外，适配体可在未知肿瘤标志物的条件下进行筛选，得到特异性适配体再通过适配体发现新的标志物。本研究的目的利用细胞SELEX技术，筛选特异性靶向结肠癌高亲和力的适配体，为结肠癌的诊断和治疗提供新的手段。
方法：利用细胞SELEX技术，以多个非肿瘤细胞系(包括人血管平滑肌细胞系HA-VSMC、人胚肺成纤维细胞HFL1、大鼠心肌细胞H9c2)作为反筛细胞，以结肠癌细胞系HCT116作为正筛细胞，筛选靶向结直肠癌细胞的适配体。在筛选过程中，首先设计为总长81个碱基的寡核苷酸DNA随机文库序列，两端分别为25个碱基的PCR上游引物序列和21个碱基的下游引物序列，中间为35个随机碱基序列。将该文库与反筛细胞孵育，去除与反筛细胞结合的序列，不结合的序列与正筛细胞孵育，去除不结合HCT116细胞的序列，通过酚氯仿抽提法提取总DNA，得到与正筛细胞结合的序列。以提取得到的DNA为模板，进行PCR扩增。对每轮PCR扩增的条件进行优化，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测PCR效率及产物的特异性得到效率高，条带单一的PCR产物。得到的PCR产物利用链霉亲和素磁珠制备单链DNA用于下一轮的筛选。
每隔五轮筛选，通过荧光共聚焦显微镜进行筛选文库与结直肠癌细胞HCT116的结合富集情况，当富集达到饱和进行克隆测序。测序结果利用软件ClustalX2进行同源性分析，挑选适配体进行二级结构分析；对筛选得到的适配体进行初步研究，利用荧光共聚焦显微镜直观观察适配体的与不同细胞(包括正筛细胞、反筛细胞、其他癌细胞)的结合情况以检测适配体的特异性。利用酶联寡聚核苷酸吸附试验方法(ELONA法)进行亲和力检测，测定适配体与HCT116细胞的解离常数Kd值。
结果：在第一轮的筛选中，通过PCR条件优化，第一次的PCR扩增的退火温度为69℃，循环数为25个循环，在该条件下，最终得到PCR产物浓度为73ng/μL,体积为120μL；第二次条件优化的PCR退火温度为69℃，循环数为12个循环，。在每轮的筛选过程中均对PCR条件进行优化，选择PCR条带单一，效率高的条件进行PCR扩增。经过15轮的筛选后，筛选文库与HCT116细胞出现明显的富集，将第十五轮筛选后的文库进行克隆测序，得到100条序列。通过ClustalX2软件分析，去除不是81个碱基的序列，得到56条序列适配体，其中1号序列有8条重复序列，2号有两条重复序列。56条序列同源性分析得到3组不同源的适配体，挑选四条适配体，取名为AptH1、AptH8、AptH9、AptH10。并通过激光共聚焦显微镜和ELONA法验证特异性和亲和力。该适配体均能能特异性靶向结肠癌细胞HCT116，其结合亲和力在8nM～22nM，其中适配体AptH8与HCT116细胞的结合Kd值为8.81±0.36nM。
结论：1.本研究通过细胞SELEX技术，利用多个非肿瘤细胞系作为反筛细胞，结直肠癌细胞系HCT116作为正筛细胞，筛选出56条靶向结直肠癌HCT116细胞的适配体，同源性分析得到3组非同源序列。
2.其中的四条适配体AptH1、AptH8、AptH9、AptH10均能特异性靶向HCT116细胞，与反筛细胞细胞几乎不结合。筛选得到的适配体能特异性靶向HCT116细胞并具有很高的亲和力，可作为进一步研究的靶分子。