1背景肿瘤热疗(hyperthermia)是继手术、放疗、化疗之后一种全新的治疗肿瘤的“绿色疗法”,是肿瘤治疗的有效手段之一,但是其作用机制长期不甚明了,近年来,随着热疗设备的不断革新和技术的不断进步,热疗已成为研究的热点。热疗于1985年获美国食品及药物管理局认证,和手术、化疗、放疗、生物免疫治疗一起成为肿瘤综合治疗的有效手段。我国卫生部于2009年11月颁布了《肿瘤深部热疗和全身热疗技术管理规范(试行)》。为探讨DR5功能性抗体抗肿瘤作用以及TRAIL/DR5相互作用的分子机制,河南大学细胞与分子免疫学实验室利用DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,制备出功能性抗DR5单克隆抗体,命名为mDRA-6。近年来,热作用于肿瘤细胞后凋亡基因表达的研究,多集中在P53、HSP-70、c-Myc等,热疗后肿瘤细胞凋亡与DR5的关系未见报道；基于热诱导细胞凋亡机制的联合治疗方法,主要集中在热疗与化疗药物、放疗等,热疗与mDRA-6、热疗与mDRA-6+化疗对肿瘤细胞凋亡的协同作用未见报道。本研究采用肝癌常见的SMMC-7721细胞系,探讨热疗对mDRA-6+热疗对肿瘤细胞的协同作用,mDRA-6+化疗+热疗对肿瘤细胞的影响,热疗导致肿瘤细胞凋亡的机制和热疗对细胞膜DR5表达、细胞内Ca2+的影响进行了初步观察。2目的探讨热疗对SMMC-7721肝癌细胞的影响,从而探讨热疗引起肿瘤细胞凋亡的可能机制；探讨热疗和人抗DR5单克隆抗体致肿瘤细胞凋亡的协同作用。3方法将SMMC-7721肝癌细胞系,置恒温循环水浴锅中42.5℃±0.5℃孵育1h,然后放入37℃,5%CO2的培养箱中继续培养,分别于热处理后0、6、12、24h,采用倒置显微镜LM×400观察细胞形态变化,采用MTT法检测细胞增殖,Annexin V/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡,抗DR5抗体366EC和FITC-羊抗鼠IgG处理细胞,流式细胞仪检测细胞DR5表达和Fluo-3/AM负载细胞检测胞内Ca2+浓度(平均荧光强度,MFI)的变化。MTT法检测抗人DR5单克隆抗体单独或联合应用顺铂或热疗对肝癌SMMC-7721细胞体外增殖的抑制作用；流式细胞仪检测不同药物对SMMC-7721细胞凋亡的影响。4结果热疗可导致肿瘤细胞形态改变,表现为细胞变小、变圆、脱落、出现空泡；热疗可抑制细胞增殖,细胞热疗1h后0h、6h、12h、24h细胞抑制率分别为：22.18%,26.76%,31.30%,36.62%。细胞凋亡率：细胞热疗1h后0h、6h、12h、24h Annexin V/PI双染,热疗后Oh细胞凋亡率为15%,其中早期凋亡率为2%,晚期凋亡率为13%;热疗后6h细胞凋亡率为65.45%,其中早期凋亡率为43.23%,晚期凋亡率为22.22%;热疗后12h,细胞凋亡率为12.32%,其中早期凋亡率为4.6%,晚期凋亡率为7.72%;热疗后24h细胞凋亡率为22.58%,其中早期凋亡率为7.15%,晚期凋亡率为15.43%。细胞热疗1h后0h、4h、8h、12h、24h细胞内钙离子浓度(平均荧光强度,MFI)分别为：18.13±0.20、13.44±0.84、7.87±3.35、13.01±2.38、37.24±1.31,对照组为14.28±3.65。细胞热疗1h后0h、6h、12h、24h细胞膜DR5表达率分别为：79.74%、83.22%、91.28%、92.52%,对照组为83.02%。未经热处理细胞增殖抑制率分别为：顺铂组32%;m-DRA-6组22%；顺铂与m-DRA-6联合组37%。热处理细胞增殖抑制率分别为：顺铂组58.06%;m-DRA-6组14.52%;顺铂与m-DRA-6联合组91.13%。细胞凋亡：未经热处理：顺铂组13.53%;m-DRA-6组13.66%;顺铂与m-DRA-6联合组84.24%。热处理组：对照组9.41%,顺铂组30.27%%,m-DRA-6组57.52%,顺铂与m-DRA-6联合组91.33%。5结论疗可提高肝癌SMMC-7721细胞膜DR5的表达,可提高肝癌SMMC-7721细胞内Ca2+；肿瘤细胞凋亡与细胞膜DR5的高表达、细胞内Ca2+的增加有关；细胞内Ca2+的增加可能是热疗致肿瘤细胞晚期凋亡的主要原因。抗人DR5单克隆抗体可增加化疗药物抗肿瘤作用,热疗与抗人DR5单克隆抗体和化疗药物有协同作用；热疗不仅可显著增加肿瘤细胞凋亡,还可增加抗人DR5单克隆抗体和化疗药物的抗肿瘤细胞作用。