粉笔作为一种重要的教学工具,在一些国家和地区的使用仍然非常普遍。粉笔教学可产生空气动力学直径<10μm的颗粒(PMlo)和<2.5μm的颗粒(PM2.5)。这些细小的颗粒物可随着人体呼吸吸入下呼吸道,特别是PM2.5易于沉积在细支气管和肺泡区域,并可能进入血液循环。因此,粉笔的使用可能影响教师和学生的健康。研究表明,教室粉笔尘短期暴露会影响教师肺气道功能；长期暴露则可能诱发呼吸系统疾病,严重者可导致尘肺。然而,有关可吸入粉笔尘在环境毒理学方面的研究还未见报道。由于粉笔尘的毒性与其物理化学性质有很大关系,本论文拟开展研究粉笔在写擦过程中产生的颗粒物形貌及化学组成；同时利用大鼠肺泡巨噬细胞(AMs)作为体外染毒模型,采用气管滴注法建立大鼠体内染毒模型,研究粉笔尘可吸入颗粒物对大鼠肺组织损伤的分子机制,为人们科学认识粉笔尘颗粒物危害提供一定的理论依据。本文利用电子探针X-射线微区分析技术(ED-EPMA)分析了来自于三种不同厂家白色无尘粉笔的粉笔尘形貌及化学组成。结果表明,三种粉笔在写擦过程中既产生>10μm的颗粒,也能产生PM10、PM2.5和PM1。这些颗粒物形状呈球形,长方体,正方体或不规则形状；X射线能谱发现粉笔尘PM2.5的主要元素成分为S、O和Ca,还含有少量C、Mg和Si等。运用Monte Carlo程序计算粉笔尘PM2.5中元素的原子浓度,并根据化学计量学推测其分子构成,结果表明粉笔尘主要由CaSO4、CaCO3/CaMg(CO3)2、CaSiO3、SiO2和少量有机粘结剂组成。本研究同时以大鼠肺泡巨噬细胞(AMs)为体外模型,采用化学发光法研究粉笔尘可吸入颗粒物诱导AMs产生活性氧和活性氮(ROS/RNS)的机理。结果发现：(1)粉笔尘PM2.5或PM1o可剂量依赖性增加AMs的化学发光；而0.5μmol/L二苯基氯化碘盐(DPI)和1 mmol/L的左旋-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)均可显著抑制粉笔尘颗粒诱导AMs的化学发光,表明粉笔尘PM2.5或PM10可引起AMs呼吸爆发,产生ROS/RNS。(2) CaSO4/CaCO3 PM2.5或PM1o浓度依赖地诱导AMs产生化学发光,且CaSO4/CaCO3相同组分的颗粒粒径越小,诱导化学发光能力越强。CaCO3颗粒诱导化学发光的能力强于同粒径CaS04。(3)抗霉素A,超氧化物歧化酶(SOD), DPI和L-NAME均可显著抑制CaSO4和CaCO3颗粒诱导AMs的化学发光,提示粉笔尘诱导AMs生成的ROS可能源于细胞内NADPH氧化酶和线粒体复合物Ⅲ, RNS则源于细胞内一氧化氮合酶(NOS)激活。结合粉笔尘化学组成分析,CaSO4和CaCO3可能是粉笔尘诱导AMs产生ROS/RNS的主要因素。为了解粉笔尘颗粒诱导生成的ROS/RNS是否对AMs造成进一步的损伤,本文同时测定了AMs中氧化应激的指标(SOD、GSH、CAT和MDA)、细胞质膜酶(Na+K+-ATP和Ca2+Mg2+-ATP)、酸性磷酸酶(ACP)、胞外NO和乳酸脱氢酶(LDH)的含量,并测定了AMs炎性细胞因子的转录水平及其细胞活性。结果表明：(1)25μg/mL粉笔尘PM2.5可显著降低AMs中SOD的活性。而100μg/mL粉笔尘PM2.5既显著降低AMs中SOD的含量,也显著增加细胞中MDA的含量。300μg/mL粉笔尘也可降低SOD活性,并可显著增加AMs中CAT活性和MDA含量。而粉笔尘PM10仅在300μg/mL时显著增加CAT活性与MDA含量,降低SOD和GSH活性。其中,所有剂量的粉笔尘PM2.5降低SOD活性的能力明显强于PM10。300μg/mL粉笔尘PM2.5增加MDA含量的能力也明显强于PM10。(2)剂量为25、100和300μg/mL粉笔尘PM2.5显著升高Ca2+Mg2+-ATP活性。而在300μg/mL剂量下,粉笔尘PM10可显著降低Na+K+-ATP、Ca2+Mg2+-ATP和ACP的活性。PM2.5与PM10相比,两者对Na+K+-ATP、Ca2+Mg2+-ATP和ACP的影响无统计学差异。(3)100和300μg/mL的粉笔PM2.5或PM10均可显著增强AMs释放NO的能力,且PM2.5释放NO的能力小于PM10。(4)在300μg/mL剂量下,粉笔PM10可显著上调TNF-α的转录水平,且与PM2.5相比两者无统计学差异；在25、100、300μg/mL三个剂量下,粉笔PM2.5均能显著增加细胞内IL-6mRNA的表达,而PMlo对IL-6的表达无显著性影响。与对照组相比,粉笔PM1o和PM25在300μg/mL下都可上调TGF-β1 mRNA表达,但两者相比并无统计学差异。这些结果表明PM10或PM2.5都可诱发AMs产生炎症反应,其中,PM2.5的效应明显强于PM10。(5)在300μg/mL剂量下,PM2.5或PM10均可引起AMs细胞外LDH增加,细胞活性降低,且PM10对细胞活性和LDH的影响较PM2.5小但并无统计学差异。总之,PM10和PM2.5对大鼠AMs产生氧化应激,引起脂质过氧化,释放NO及调节TNF-α和TGF-β的转录水平,引起炎症损伤,但PM2.5诱导氧化应激和炎症反应的能力强于PM10。本文同时利用HE染色研究了粉笔尘PM2.5染毒大鼠的肺组织病理学,应用荧光定量RT-PCR法和western blot研究了染毒大鼠肺组织中炎症因子(TNF-α、IL-6、 iNOS和ICAM)及其他纤维化因子(VEGF-A、TF、TGF-p、PDGF-D等)的转录水平及p38、ERK1/2、JNK-2 MAPK、STAT-3和Smad-3的蛋白表达。结果发现：(1)8和32 mg/kg粉笔尘可使大鼠肺组织中IL-6 mRNA表达增加。32 mg/kg染毒组大鼠肺组织中TNF-α mRNA表达增加。(2)8和32 mg/kg粉笔PM2.5均可上调染毒组大鼠肺组织iNOS mRNA表达。提示炎性细胞因子的增加可能导致NO增加。(3)2、8、32 mg/kg三个剂量组均可使ICAM-1 mRNA表达上调,表明粉笔尘PM2.5可促进炎性细胞的迁移和趋化,释放炎性细胞因子TNF-α和IL-6,加快炎症反应的发展。(4)HE染色表明与对照组相比,8和32 mg/kg粉笔尘PM2.5可使大鼠肺组织出现轻微的组织损伤,比如局部的充血,炎性细胞浸润。(5)与生理盐水组相比,2、8、32 mg/kg三个剂量组均可剂量依赖性地增加染毒大鼠肺组织内VEGF-A、STAT-3和Col Iα1 mRNA的表达水平。8和32 mg/kg剂量组可使TGF-β、PDGF-D、PDGFR-β mRNA的表达显著增加。32 mg/kg剂量组可使Smad-3 mRNA的表达显著增加。三个剂量组染毒对大鼠肺组织中TF mRNA的表达及STAT-3和Smad-3蛋白表达无显著影响。(6)在8和32 mg/kg剂量下,粉笔尘PM2.5可显著提高HO-1 mRNA表达。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可显著降低32 mg/kg剂量下粉笔尘PM2.5对HO-1 mRNA表达的影响。(7)8和32 mg/kg剂量组可使大鼠肺组织中p38蛋白表达增加,32 mg/kg剂量组可使大鼠肺组织中ERKs蛋白表达增加。表明高剂量的粉笔尘PM25对肺组织的损伤与p38和ERKs信号通路有关,而在8 mg/kg剂量下p38信号通路可能起主要作用。(8)NAC可使肺组织中VEGF-A、PDGF-D/PDGFR-β、Col Iα1的转录水平显著降低。表明NAC对PM2.5诱导的氧化损伤有一定的保护作用,从而缓解粉笔PM25诱导的炎症反应和纤维化反应。综上所述,粉笔尘可吸入颗粒物可诱导AMs产生呼吸爆发,释放ROS/RNS。过量的ROS/RNS肖耗细胞内抗氧化酶,引起脂质过氧化,造成氧化损伤。同时,这些颗粒物可引起ACP酶活性降低,NO释放量增加；而两者也能诱发AMS的炎症损伤。其中PM2.5诱导氧化应激和炎症损伤的能力强于PM10；而就PM2.5的体内毒性而言,PM2.5可通过p38和ERKs MAPK通路诱导大鼠肺组织炎症因子和纤维化相关因子表达上调,NAC对粉笔尘PM2.5造成的肺损伤有一定的保护作用。