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欧洲葡萄品种(Vitis vinifera L.)品质优良、被广泛栽培在世界广大地区,其主要缺点是抗病性差;改良优质欧洲葡萄品种抗病性成为葡萄抗病育种的目标之一。遗传工程转基因生物技术是定向改良葡萄抗病性快捷途径之一。本研究以酿酒葡萄品种霞多丽(V.vinifera cv.Chardonnay)、梅鹿特(V.vinifera cv.Merlot)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)、品丽珠(V.vinifera cv.Cabernet Franc)、鲜食葡萄品种红地球(V.vinifera cv.Red Globe)为材料,建立并优化葡萄体细胞胚发生途径。在此再生途径的基础上,建立葡萄遗传转化体系,将课题组前期从抗白粉病的华东葡萄白河葡萄-35-1中克隆的抗白粉病相关基因芪合成酶基因Vp STSg DNA2、泛素连接酶基因Vp UR9、病程相关蛋白基因Vp PR4-1,通过农杆菌介导方法转化至感病的欧洲葡萄品种中,研究基因的抗病功能,为改良欧洲葡萄品种抗病性提供依据。本研究取得的主要结果如下:1.体细胞胚再生途径建立:霞多丽、梅鹿特、品丽珠、赤霞珠的花蕾在胚性愈伤诱导培养基(MS1、PIV、MC)上能够诱导出胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC),基因型影响胚性愈伤诱导率,其中霞多丽、梅鹿特的平均胚性愈伤诱导效率分别为12.00%和9.05%,高于品丽珠(0.03%)、赤霞珠(0.83%)。三种胚性愈伤诱导培养基中,PIV培养基适于多种基因型葡萄胚性愈伤诱导。霞多丽、品丽珠、赤霞珠适宜在PIV培养基上诱导胚性愈伤,其诱导率分别为13.8、0.1和1.3%;梅鹿特在MC培养基上胚性愈伤诱导效率较好,为12.1%。添加毒莠定能提高霞多丽胚性愈伤诱导效率。霞多丽小花蕾在2.0mg L-16-BA、0.5mg L-12,4-D、3.0mg L-1毒莠定的MS培养基上诱导效率提高至16.4%。梅鹿特和实验室前期诱导的红地球葡萄的胚性愈伤在X6培养基上能够保持和扩繁,霞多丽适宜的胚性保持和扩繁培养基是添加2mg L-1毒莠定的MS培养基。梅鹿特和红地球体细胞胚(Somatic embryo,SE)在添加0.2mg L-16-BA的MS培养基成苗数分别为57、63株/0.1g原胚团(Proembryonic masses,PEM)。而霞多丽葡萄在此培养基上成苗数为18株/0.1g PEM,通过优化培养基成分,霞多丽适宜的体细胞胚萌发成苗培养基是0.2mg L-1KT、0.1mg L-1NOA的MS培养基。2.遗传转化方法比较与获得转芪合成酶基因葡萄植株:利用农杆菌介导和基因枪转化方法,将葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)转入霞多丽PEM中,并对抗性的体胚进行GUS染色,结果表明农杆菌介导的获得的抗性体细胞胚中GUS表达量高于基因枪遗传转化法。利用农杆菌介导法将芪合成酶基因Vp STSg DNA2转化欧洲葡萄品种霞多丽、梅鹿特、红地球的胚性愈伤、原胚团、体细胞胚三种类型的胚性材料中,结果表明不同胚性材料的转化效率不同。胚性愈伤和体细胞胚在筛选过程中褐化、不能恢复,原胚团在筛选过程中再生形成抗性材料,因此原胚团为葡萄的适宜的遗传转化受体材料。基因型影响原胚团的恢复与再生,试验中分别获得69、3、2株霞多丽、梅鹿特、红地球的抗性株系。PCR检测结果表明,32株霞多丽抗性株系为阳性株系,其余葡萄未检测到目的片段。3.转芪合成酶基因Vp STSg DNA2葡萄植株分子检测:转白河-35-1中芪合成酶基因Vp STSg DNA2的霞多丽叶片接种白粉菌[Uncinula necator(Schw.)Burr.]表明,转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽叶片中Vp STSg DNA2受白粉菌诱导转录;在Vp STSg DNA2转录的同时,查尔酮合成酶基因转录受抑制,Vp STSg DNA2的产物反式白藜芦醇和ε-葡萄素含量的增加。同时,转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽葡萄叶片中有H2O2的积累。转芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多丽葡萄叶片上的白粉菌菌丝密度低于对照霞多丽葡萄叶片。初步表明,欧洲葡萄品种霞多丽转入Vp STSg DNA2基因的植株能够抑制白粉菌菌丝的生长、提高转基因植株对白粉菌的抗病能力。4.获得转泛素连接酶基因Vp UR9葡萄植株与分子检测:利用同源克隆方法,分离获得华东葡萄白河-35-1泛素连接酶基因Vp UR9,经预测分析,该基因编码164个氨基酸,具有保守RING结构域,该基因转录受白粉菌和水杨酸调控。构建该基因植物表达载体,并通过农杆菌介导转入欧洲葡萄品种霞多丽、梅鹿特、红地球中过量表达。通过筛选得到15个转化泛素连接酶基因Vp UR9红地球株系,对FLAG-tag进行western blotting检测,其阳性率为80%,其余葡萄未获得阳性植株,Kan抗性适宜红地球葡萄的转化及筛选。接种白粉菌结果表明,转泛素连接酶基因Vp UR9的红地球对白粉菌的抗性减弱。5.获得转病程相关蛋白基因Vp PR4-1葡萄植株与分子检测:利用同源克隆方法,分离获得华东葡萄白河-35-1中的病程相关蛋白基因Vp PR4-1。经预测分析,该基因编码143个氨基酸,其转录受白粉菌、水杨酸、茉莉酸甲酯调控。Vp PR4-1蛋白具有DNase活性,该蛋白定位于细胞核、细胞质、细胞膜上。构建病程相关蛋白基因Vp PR4-1过量植物表达载体,并通过农杆菌介导转化法将其转入欧洲葡萄品种红地球中。最终得到30株红地球转化病程相关蛋白基因Vp PR4-1的红地球植株,对Vp PR4-1进行western blotting检测,其中26个株系Vp PR4-1蛋白表达量升高。通过白粉菌接种及观察,初步认为转化病程相关蛋白基因Vp PR4-1的红地球葡萄对白粉菌的抗性增强。综上,欧洲葡萄品种转入中国野生葡萄抗病基因是可行的,这为定向改良与提高栽培的欧洲葡萄品种的抗病性提供了依据;下一步研究重点是优化调节胚性愈伤组织扩繁方法,延长胚性材料的保存方法与增殖效率;提高转基因效率;促进转基因植株生长发育,按照科学程序,进入田间观察开花结果,为这项研究的应用提供有价值的依据。