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胰腺癌是恶性程度非常高的消化系统外分泌肿瘤。最近几年的报道都有指出胰腺癌的发病率和死亡率都有出现明显上升的趋势。据报道，胰腺癌在发达国家的发病率比发展中国家高。在我国男性胰腺癌的发病率已经与欧美发达国家相接近。根据美国一项研究表明，该研究发现，在1973年至2014年间，胰腺癌的年龄标准化发病率每年增加1.03％。这预示着到2030年，预计胰腺癌将成为美国癌症相关死亡的第4个到第2个最常见的原因。
胰腺癌一旦确诊后首要的根治性的诊疗方案是外科手术。但由于胰腺癌患者发现常常为晚期并且有相当一部分的患者伴有远处转移，所以手术的根治率不高。现在已经证明在手术治疗中加入辅助化疗可以提高存活率。吉西他滨作为一种高效的化疗药物，已经被应用于各种的肿瘤治疗中。而且吉西他滨现在已经作为胰腺癌晚期的标准化治疗方案之一。但是吉西他滨本身也有缺陷。由于胰腺癌晚期的患者相对长期使用，自身的胰腺癌细胞对吉西他滨产生一定的耐药性。而且吉西他滨也有一定的毒副作用。所以现在需要再去寻找其他化疗药物。吴茱萸碱（EVO）作为一种有效的抗肿瘤药物，它的效果引人注目。而且有相当一部分的研究已经聚焦于此。有一些研究发现，吴茱萸碱能抑制多种恶性肿瘤的生长并且促进他们的凋亡。然而，EVO对胰腺癌凋亡与自噬的影响尚未有人提及。因此，我们旨在研究EVO对体外和体内人胰腺癌（PC）细胞系的增殖，凋亡和自噬的影响。我们对EVO抗胰腺癌的作用及其机制进行研究，为胰腺癌的临床治疗提供一种新的治疗方案和有效药物。
吴茱萸碱促进胰腺癌细胞凋亡并抑制胰腺癌细胞自噬形成的实验研究
目的：
1、观察吴茱萸碱对人胰腺癌细胞株的生物学效应。
2、探讨吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞株凋亡作用机制。
3、探讨吴茱萸碱抑制人胰腺癌细胞株自噬形成的作用机制。
4、探讨吴茱萸碱是否能直接抑制裸鼠PANC1细胞移植瘤的生长及其可能的作用机制。
方法
1、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（0um、0.5um、1.0um、2.5um、5.0um、10.0um）中，并使用细胞计数试剂盒（CCK）-8测定EVO对胰腺癌细胞增殖的影响。我们用细胞伤口划痕实验显示吴茱萸碱抑制PC细胞活力和迁移。
2、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且使用流式细胞术检测细胞的凋亡。我们使用Western印迹来检测SW1990和PANC1中的凋亡相关蛋白P-AKT、AKT、P-ERK1/2、ERK1/2、P-P38、P38的变化情况以进一步明确吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞SW1990和PANC1凋亡的作用机制。将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且通过DAPI染色观察细胞核的形态来更加直观的鲜明吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞的凋亡作用。
3、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1（通过营养缺乏的方法诱导其凋亡）暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且使用免疫荧光技术检测LC3II在细胞中的表达。我们使用Western印迹来检测SW1990和PANC1中的自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、P-STAT3、STAT3、P62的变化情况以进一步明确吴茱萸碱抑制人胰腺癌细胞SW1990和PANC1自噬的作用机制。
4，我们把PANC1细胞用于在裸鼠中建立原位移植的胰腺肿瘤模型。32只裸鼠接种PANC1胰腺癌细胞，4周后，待所有的裸鼠的原位移植瘤均可在其腹部触及时将荷瘤鼠用随机区组设计分成4个组，每组8只：生理盐水组（N组），吴茱萸碱组10mg/kg，吴茱萸碱组20mg/kg，吴茱萸碱组30mg/kg.各组均采取腹腔注射药物，三天一次，总共10次。在末次用药一周后，我们使用高分辨率正电子发射断层扫描（Micro-PET）和氟-18-标记的氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）监测小鼠的肿瘤/非肿瘤（T/NT）比率和标准摄取值（SUV），随后对其进行安乐死以测量移植的肿瘤重量。我们将裸鼠的肿瘤组织取出后存放于液氮中。我们采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中的P-AKT、P-ERK1/2和P-P38的表达水平。
结果
1、在体外，吴茱萸碱能显著人胰腺癌细胞的增殖。不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）作用SW1990和PANC1细胞48h后存活率分别为51%、26%、15%和65%、35%、15%，呈明显浓度依赖性（*P＜0.05）；我们发现，随着吴茱萸碱浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞的迁移率为55%、44%、35%和63%、35%、23%，也同样呈明显浓度依赖性（*P＜0.05）。
2、在体外，吴茱萸碱作用后的SW1990和PANC1细胞呈现出细胞凋亡的典型现象，AnnexinV联合PI法染色结果显示，随着吴茱萸碱浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞的凋亡率也增加。说明该作用具有药物依赖性。同样的吴茱萸碱通过抑制AKT,ERK1/2和P38的磷酸化的表达，从而使细胞出现程序性的死亡。通过DAPI染色我们可以看到，随着吴茱萸碱的浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞在48小时后细胞核出现明显的聚缩和发亮。这也间接说明吴茱萸碱能诱导SW1990和PANC1细胞的凋亡。
3、在体外，通过免疫荧光检测发现，LC3II在SW1990和PANC1细胞的表达量随着吴茱萸碱的浓度升高而降低。通过Western印迹检测我们发现随着吴茱萸碱浓度的提高，在SW1990和PANC1细胞中STAT3的磷酸化过程被抑制，与此同时，LC3II也被下调，P62被增强。
4、末次用药一周后我们发现，与对照组相比吴茱萸碱治疗组的T/N比值，SUV和肿瘤重量下降更明显。使用免疫组织化学检测的P-AKT、P-ERK和P-P38肿瘤表达随着体内EVO剂量的增加而降低。
结论
1、吴茱萸碱对胰腺癌SW1990和PANC1细胞的增殖具有明显抑制作用，且有剂量和时间依赖性，能明显诱导胰腺癌SW1990和PANC1细胞凋亡。
2、吴茱萸碱可显著抑制SW1990和PANC1细胞中的AKT,ERK1/2和P38的磷酸化的过程，从而诱导胰腺癌细胞的凋亡。在下调LC3蛋白表达过程中，吴茱萸碱同时能抑制胰腺癌细胞STAT3的磷酸化，并增强P62的表达，从而抑制胰腺癌细胞自噬的形成。
3、吴茱萸碱对裸鼠胰腺癌PANC1细胞移植瘤的抑瘤效果也具有浓度依赖性，其机制可能是吴茱萸碱抑制胰腺癌组织中的Akt，ERK1/2和p38的磷酸化过程，诱导凋亡的形成，促进胰腺癌细胞的死亡。
胰腺癌一旦确诊后首要的根治性的诊疗方案是外科手术。但由于胰腺癌患者发现常常为晚期并且有相当一部分的患者伴有远处转移，所以手术的根治率不高。现在已经证明在手术治疗中加入辅助化疗可以提高存活率。吉西他滨作为一种高效的化疗药物，已经被应用于各种的肿瘤治疗中。而且吉西他滨现在已经作为胰腺癌晚期的标准化治疗方案之一。但是吉西他滨本身也有缺陷。由于胰腺癌晚期的患者相对长期使用，自身的胰腺癌细胞对吉西他滨产生一定的耐药性。而且吉西他滨也有一定的毒副作用。所以现在需要再去寻找其他化疗药物。吴茱萸碱（EVO）作为一种有效的抗肿瘤药物，它的效果引人注目。而且有相当一部分的研究已经聚焦于此。有一些研究发现，吴茱萸碱能抑制多种恶性肿瘤的生长并且促进他们的凋亡。然而，EVO对胰腺癌凋亡与自噬的影响尚未有人提及。因此，我们旨在研究EVO对体外和体内人胰腺癌（PC）细胞系的增殖，凋亡和自噬的影响。我们对EVO抗胰腺癌的作用及其机制进行研究，为胰腺癌的临床治疗提供一种新的治疗方案和有效药物。
吴茱萸碱促进胰腺癌细胞凋亡并抑制胰腺癌细胞自噬形成的实验研究
目的：
1、观察吴茱萸碱对人胰腺癌细胞株的生物学效应。
2、探讨吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞株凋亡作用机制。
3、探讨吴茱萸碱抑制人胰腺癌细胞株自噬形成的作用机制。
4、探讨吴茱萸碱是否能直接抑制裸鼠PANC1细胞移植瘤的生长及其可能的作用机制。
方法
1、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（0um、0.5um、1.0um、2.5um、5.0um、10.0um）中，并使用细胞计数试剂盒（CCK）-8测定EVO对胰腺癌细胞增殖的影响。我们用细胞伤口划痕实验显示吴茱萸碱抑制PC细胞活力和迁移。
2、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且使用流式细胞术检测细胞的凋亡。我们使用Western印迹来检测SW1990和PANC1中的凋亡相关蛋白P-AKT、AKT、P-ERK1/2、ERK1/2、P-P38、P38的变化情况以进一步明确吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞SW1990和PANC1凋亡的作用机制。将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且通过DAPI染色观察细胞核的形态来更加直观的鲜明吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞的凋亡作用。
3、在体外，将人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1（通过营养缺乏的方法诱导其凋亡）暴露于不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）中，并且使用免疫荧光技术检测LC3II在细胞中的表达。我们使用Western印迹来检测SW1990和PANC1中的自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、P-STAT3、STAT3、P62的变化情况以进一步明确吴茱萸碱抑制人胰腺癌细胞SW1990和PANC1自噬的作用机制。
4，我们把PANC1细胞用于在裸鼠中建立原位移植的胰腺肿瘤模型。32只裸鼠接种PANC1胰腺癌细胞，4周后，待所有的裸鼠的原位移植瘤均可在其腹部触及时将荷瘤鼠用随机区组设计分成4个组，每组8只：生理盐水组（N组），吴茱萸碱组10mg/kg，吴茱萸碱组20mg/kg，吴茱萸碱组30mg/kg.各组均采取腹腔注射药物，三天一次，总共10次。在末次用药一周后，我们使用高分辨率正电子发射断层扫描（Micro-PET）和氟-18-标记的氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）监测小鼠的肿瘤/非肿瘤（T/NT）比率和标准摄取值（SUV），随后对其进行安乐死以测量移植的肿瘤重量。我们将裸鼠的肿瘤组织取出后存放于液氮中。我们采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中的P-AKT、P-ERK1/2和P-P38的表达水平。
结果
1、在体外，吴茱萸碱能显著人胰腺癌细胞的增殖。不同浓度的吴茱萸碱（1.0um、5.0um、10.0um）作用SW1990和PANC1细胞48h后存活率分别为51%、26%、15%和65%、35%、15%，呈明显浓度依赖性（*P＜0.05）；我们发现，随着吴茱萸碱浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞的迁移率为55%、44%、35%和63%、35%、23%，也同样呈明显浓度依赖性（*P＜0.05）。
2、在体外，吴茱萸碱作用后的SW1990和PANC1细胞呈现出细胞凋亡的典型现象，AnnexinV联合PI法染色结果显示，随着吴茱萸碱浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞的凋亡率也增加。说明该作用具有药物依赖性。同样的吴茱萸碱通过抑制AKT,ERK1/2和P38的磷酸化的表达，从而使细胞出现程序性的死亡。通过DAPI染色我们可以看到，随着吴茱萸碱的浓度的增加（1.0um、5.0um、10.0um），SW1990和PANC1细胞在48小时后细胞核出现明显的聚缩和发亮。这也间接说明吴茱萸碱能诱导SW1990和PANC1细胞的凋亡。
3、在体外，通过免疫荧光检测发现，LC3II在SW1990和PANC1细胞的表达量随着吴茱萸碱的浓度升高而降低。通过Western印迹检测我们发现随着吴茱萸碱浓度的提高，在SW1990和PANC1细胞中STAT3的磷酸化过程被抑制，与此同时，LC3II也被下调，P62被增强。
4、末次用药一周后我们发现，与对照组相比吴茱萸碱治疗组的T/N比值，SUV和肿瘤重量下降更明显。使用免疫组织化学检测的P-AKT、P-ERK和P-P38肿瘤表达随着体内EVO剂量的增加而降低。
结论
1、吴茱萸碱对胰腺癌SW1990和PANC1细胞的增殖具有明显抑制作用，且有剂量和时间依赖性，能明显诱导胰腺癌SW1990和PANC1细胞凋亡。
2、吴茱萸碱可显著抑制SW1990和PANC1细胞中的AKT,ERK1/2和P38的磷酸化的过程，从而诱导胰腺癌细胞的凋亡。在下调LC3蛋白表达过程中，吴茱萸碱同时能抑制胰腺癌细胞STAT3的磷酸化，并增强P62的表达，从而抑制胰腺癌细胞自噬的形成。
3、吴茱萸碱对裸鼠胰腺癌PANC1细胞移植瘤的抑瘤效果也具有浓度依赖性，其机制可能是吴茱萸碱抑制胰腺癌组织中的Akt，ERK1/2和p38的磷酸化过程，诱导凋亡的形成，促进胰腺癌细胞的死亡。