目的:本研究在前期试验基础上,继续研究麦芽中总生物碱物质的提取纯化工艺。利用现代化药理学研究方法,复制高泌乳素血症动物疾病模型,对麦芽不同极性部位和不同化学部位,以及纯化后生物碱物质开展药效学试验,筛选出麦芽治疗HPRL有效部位,并阐明其作用机制。方法:(一)称取适量麦芽用70%乙醇回流提取浸膏,加水溶解制成混悬液后依次加入石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取得到不同极性部位提取物,再对各个部位中的化学成分进行含量测定。根据相关文献,选择水做溶剂,40℃水浴,提取得到麦芽总多糖粗提物;用70%乙醇回流提取,然后通过聚酰胺树脂柱进行简单的纯化,得到麦芽总黄酮粗提物;用70%乙醇超声提取,然后通过HPD-600大孔树脂柱进行简单的纯化,得到麦芽总酚粗提物。麦芽总生物碱粗提物制备和含量测定方法依据本课题组前期的实验方法进行。(二)根据单因素实验选择麦芽中生物碱物质的提取溶剂,再进行正交试验,以总生物碱和大麦芽碱提取量的综合评分为评价指标,优选出麦芽生物碱物质的最佳提取工艺。再以总生物碱的转移率和纯度为评价指标,比较柱层析法和溶剂萃取法对麦芽总生物碱的纯化效果,同时对溶剂萃取法中脱脂溶剂、水浴温度以及氨水碱化溶液至不同PH值进行考察,优选麦芽总生物碱的最佳纯化工艺。(三)高泌乳素血症模型的建立:除正常组大鼠外,其它各组大鼠背部皮下注射盐酸甲氧氯普胺注射液50mg/kg体重,每天上午下午分别定时注射1次,连续5天。分组给药:将120只雌性未孕SD大鼠随机分为12组:正常组、模型组、石油醚和乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组、原药材水提物组、总生物碱粗提部位组、总多糖粗提部位组、总黄酮粗提部位组、总酚粗提部位组、生物碱低浓度组、生物碱高浓度组,每组10只。模型制备后开始给药,石油醚和乙酸乙酯部位组给药剂量为114.70mg·kg-1·d-1;正丁醇部位组给药剂量为124.17mg·kg-1·d-1;水部位组给药剂量为645.96mg·kg-1·d-1;原药材水提物组给药剂量为4.74g·kg-1·d-1;总生物碱粗提部位组给药剂量为592.43mg·kg-1·d-1;总多糖粗提部位组给药剂量为1.57g·kg-1·d-1;总黄酮粗提部位组给药剂量为57.83mg·kg-1·d-1;总酚粗提部位组给药剂量为103.39mg·kg-1·d-1;生物碱低浓度组给药剂量为0.87mg·kg-1·d-1;生物碱高浓度组给药剂量为1.74 mg·kg-1·d-1。正常组和模型组给予等容量的蒸馏水,连续灌胃30d。对高泌乳素血症大鼠血清激素含量的检测:末次给药24h后,所有大鼠禁食12小时,自由饮水。各组大鼠于次日上午心脏取血2ml,血液静置后以3000转/min的速度离心5min,取血清供检测。采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠血清中泌乳素(PRL)、雌激素(E2)、孕酮(P)的含量,严格按照ELISA试剂盒说明书中操作流程进行。对高泌乳素血症大鼠脑垂体泌乳素阳性细胞含量及mRNA表达的影响:正常组、模型组、总生物碱粗提部位组、总多糖粗提部位组、总黄酮粗提部位组、总酚粗提部位组、生物碱低浓度组和生物碱高浓度组大鼠末次给药24h后,于次日上午用20%乌拉坦麻醉后取其脑垂体。取1/2大鼠脑垂体于组织固定液中充分固定24小时,石蜡包埋切片后,进行免疫组化实验,测定PRL细胞阳性的累积光密度值(IOD)。取另外的1/2大鼠脑垂体进行PRL mRNA荧光定量PCR实验,计算扩张倍数,进行统计学分析。对高泌乳素血症大鼠乳腺增生情况的影响实验:正常组、模型组、原药材组水提物组、总生物碱粗提部位组、总多糖粗提部位组、总黄酮粗提部位组、总酚粗提部位组、生物碱低浓度组和生物碱高浓度组大鼠末次给药24h后,于次日上午用20%乌拉坦麻醉后取其第二对乳腺组织,于4%多聚甲醛组织固定液中充分固定24小时后,包埋,切片进行HE染色,在显微镜下观察各组大鼠乳腺组织情况,包括乳腺小叶腺泡数、导管的形状及上皮细胞数、腺泡和导管内有无分泌物。结果:(一)水部位中得到的浸膏量最多,其次是正丁醇部位,总生物碱物质集中存在于正丁醇和水部位中,总黄酮物质主要在石油醚和乙酸乙酯部位中含量最高,三个不同极性部位中总酚物质含量差异不大。提取到的总多糖粗提物中总多糖的含量达到了98.09%,总黄酮粗提物中总黄酮的含量为9.83%,总酚粗提物中总酚的含量为4.84%。(二)优选出总生物碱的提取纯化工艺为:称取麦芽粗粉,加入5倍量80%甲醇,超声提取3次,每次提取45 min,收集滤液浓缩蒸干后用PH 1~2的HCl水溶液溶解,过滤,滤液中加入3倍量石油醚萃取3次,收集水层溶液用浓氨水调溶液PH=11,在冰箱中静置,收集沉淀,沉淀用PH=11的氨水溶液洗涤数次后弃去,合并滤液于分液漏斗中,加入3倍量的氯仿萃取5次,1h/次,合并氯仿层溶液于60℃水浴蒸干溶剂,用0.03%HCl水溶液溶解,滤过,即得总生物碱部位纯度为56.64%。不同产地生麦芽中生物碱物质含量相差较大,安徽亳州产的生麦芽中生物碱物质含量最高,生大麦中不含大麦芽碱,炒麦芽中生物碱物质的含量比生麦芽要低。(三)对血清中PRL含量的影响:与正常组(4.714±5.159 pg·ml-1)比较,模型组大鼠血清中PRL的含量明显升高(30.404±5.516 pg·ml-1,P<0.01);与模型组比较,不同极性部位组大鼠血清中PRL的含量均有所降低,仅总生物碱粗提部位组有显著性差异(11.051±5.516pg·ml-1,P<0.01),该组大鼠血清中PRL的含量最低接近正常组大鼠血清中PRL的含量。与模型组比较,总生物碱粗提部位组、生物碱低浓度组(11.571±4.263 pg·ml-1)和生物碱高浓度组(7.004±4.044 pg·ml-1)均有极显著性差异(P<0.01),其中生物碱高浓度组大鼠血清中PRL的含量最低接近正常值。对血清中P含量的影响:不同极性部位比较可知,与正常组(1.283±0.116 ng·ml-1)相比较,模型组大鼠血清中P的含量明显升高(1.993±0.116 ng·ml-1,P<0.01);与模型组比较,石油醚和乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组以及水部位组大鼠血清中P的含量均有升高。原药材水提物组和总生物碱粗提部位组大鼠血清中P的含量均有降低,其中总生物碱粗提部位组有极显著性差异(1.46±0.135ng·ml-1,P<0.01)。不同化学部位比较可知,与模型组比较,各组大鼠血清中P的含量均有所降低,且相差不大。其中总生物碱粗提部位组、总多糖粗提部位组、总黄酮粗提部位组、总酚粗提部位组和生物碱高浓度组有极显著性差异。对血清中E2含量的影响:不同极性部位比较可知,与正常组(69.919±5.986 pg·ml-1)相比较,模型组大鼠血清中E2的含量明显升高(100.825±5.986 pg·ml-1,P<0.01);与模型组比较,原药材水提物组(68.949±6.309 pg·ml-1)和总生物碱粗提部位组(64.550±5.986 pg·ml-1)有显著性降低(P<0.01),其余各组均无显著性差异。不同化学部位比较可知,与模型组比较,各组大鼠血清中E2的含量均有所降低。泌乳素阳性染色于胞浆中,呈棕黄色。泌乳素细胞的累积光密度值越大表明阳性反应越大。与正常组(0.0068±0.0016)比较,模型组有显著性差异(0.0553±0.0172,P<0.05),且泌乳素细胞的单位面积平均光密度值明显高于正常组。与模型组比较,总生物碱粗提部位组(0.0097±0.0026)、生物碱低浓度组(0.0087±0.0028)和生物碱高浓度组(0.0070±0.0019)均有显著性差异(P<0.05),总生物碱粗提部位组泌乳素细胞的阳性反应比其他三个化学部位要小,但比生物碱高浓度组要大。PRL mRNA在各组大鼠脑垂体组织中都有表达,与正常组(6.23±1.12)比较,模型组有显著性差异(22.11±3.86,P<0.05)。与模型组比较,总生物碱粗提部位组(5.95±1.07)、生物碱低浓度组(6.14±1.36)和生物碱高浓度组(4.32±1.08)均有显著性差异(P<0.05),PRL mRNA的表达水平明显低于模型组。正常组大鼠乳腺组织中小叶不增生,腺泡少,导管不扩张,无分泌物,为0级增生。模型组大鼠乳腺组织小叶腺泡部分增生,导管扩张,无分泌物,为二级增生,表明高泌乳素血症伴随乳腺增生。总生物碱粗提部位组、总黄酮粗提部位组和总酚粗提部位组大鼠乳腺组织中小叶个别腺泡增生,导管不扩张,无分泌物,为一级增生。生物碱高浓度组大鼠乳腺组织中小叶不增生,腺泡少,导管不扩张,无分泌物,为0级增生。结论:(一)结果显示麦芽中生物碱物质含量较低,传统水提方法无法将其大量提取出,为中医临床大剂量使用麦芽回乳的用法找到了物质基础依据。(二)优选后的纯化方法可获得纯度大于50%的麦芽总生物碱部位,为药效学实验及化学成分分析研究提供了符合要求的样品。(三)确证了麦芽治疗高泌乳素血症的药效物质为其所含生物碱,作用机制是通过减少大鼠脑垂体PRL阳性细胞数量,下调脑垂体PRL细胞mRNA的表达,从而降低了大鼠体内PRL含量,达到治疗HPRL的目的。