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铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是一种非发酵革兰阴性杆菌，在医院获得性感染中较为常见。PA耐药机制较为复杂，其中整合子特别是Ⅰ类整合子介导的多重耐药机制正日益引起人们的重视。由于PA对多种抗菌药物表现为天然或获得性多重耐药，其所致感染可供选择的有效抗菌药物甚少，使得临床治疗的难度大为增加。这种状况已使抗生素治疗PA感染面临困境，这一方面促使人们不断更新和研制新型抗生素，寻求有效的治疗方案；另一方面激发人们寻找新型广谱疫苗，提高易感人群的特异性抗感染免疫能力，避免PA感染带来的困窘。本研究基于镇江地区PA的耐药状况，利用信号接头分子MyD88对病原刺激信号的细胞内传递作用，研制广谱、高效的PA核酸疫苗。
目的:(1)了解分离于镇江地区的PA对十三种常用抗生素的耐药状况，明确Ⅰ类整合子基因盒结构及其在耐药基因播散中的作用。
(2)原核表达PA外膜蛋白OPrF建立检测抗PA抗体的ELISA方法，以用于判断本研究所制备的疫苗效果。
(3)研制PA OprF表位核酸疫苗，利用MyD588的佐剂作用增强免疫应答。
方法:(1)采用K-B纸片法检测71株PA的耐药率；煮沸法提取71株PA基因组DNA；PCR扩增Ⅰ类整合子基因；测序分析其所携带的耐药基因盒；脉冲场电泳分析优势携带Ⅰ类整合子的PA菌株间的关系。
(2)SDS-蛋白酶K提取PA基因组DNA，并以此为模板扩增OprF基因，T-A克隆后将此基因插入PET-32(a)载体，构建重组载体PET-32(a)-OprF，在E. coli BL21中表达，用Ni-NTA层析柱纯化目的蛋白。将纯化蛋白包被ELISA板，建立检测PA抗体的ELISA检测方法，为疫苗免疫机体产生抗体效果的检测奠定基础。 (3)优选PAOprF的三个中和性B细胞表位，并将此三表位及一个外源通用T细胞表位串联，表位之间用赖氨酸间隔，再采用大肠埃希菌的优势密码子，将上述构建的疫苗的氨基酸序列转换为DNA序列。采用重叠PCR方法合成全基因，并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因，将此获得的片段与MyD88基因同时连接到双表达载体pIRES中，构建pIRES-tPA-OprF：MyD88重组质粒。通过PCR、酶切及序列测定进行鉴定。将pIRES-tPA-OprF：MyD88重组质粒免疫Balb/c小鼠，ELISA法检测血清特异性抗体水平。建立小鼠肺部感染PA动物模型，通过检测各组小鼠血清中特异性抗体水平、鼠肺细菌计数等，判断研制的PA核酸疫苗的免疫效果和对受染小鼠的保护作用。
结果:(1)71株PA对临床常用的13种抗生素的耐药率在18.3％～77.5％不等；Ⅰ类整合子检出率为38％，包括aadB、aac(6)-Ⅱ、PSE-ⅠdfrA17和aadA5五种基因盒，其中最常见者为dfrA17和aadA5。Ⅰ类整合子阳性菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、左氧氟沙星、环丙沙星等10种抗生素的耐药率明显高于整合子阴性菌株。PFGE分析22株携带1.6kb Ⅰ类整合子的PA流行规律。
(2)扩增得到OprF基因，编码区cDNA的全长459 bp，编码153个氨基酸残基，与GenBank中发表的序列完全一致。将OprF基因克隆到pET32a原核表达载体，获得重组载体PET-32(a)-OprF。将重组质粒转化至E. coli M15，IPTG诱导蛋白表达，Ni-NTA层析柱纯化获得目的蛋白。将纯化蛋白包被ELISA板，建立了PA抗体检测方法。 (3)构建了PA表位核酸疫苗，体内试验证实，小鼠血清中特异性抗体水平较高，对PA的感染具有免疫保护。
结论:(1)不同PA临床株对十三种常用抗生素的耐药率各不相同，整合子阳性菌株耐药率明显高于整合子阴性菌株，提示Ⅰ类整合子是PA多重耐药的重要因素。
(2)成功克隆了OprF基因并获得原核表达蛋白，重组蛋白具有较强的免疫原性，用其免疫动物获得较高效价的特异性抗体，并以此建立了PA抗体ELISA检测方法和成功用于PA核酸疫苗效果评价。
(3)成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗，动物实验证实该核酸疫苗免疫效果明显高于无MyD88基因的核酸疫苗，表明作为抗原信号接头分子MyD88的正向免疫调节作用，以及应用MyD88基因与优势抗原基因重组构建新型高效核酸疫苗的可行性，为临床应用提供了实验依据。