研究背景与目的肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,外科手术是对肝癌患者治疗的有效手段,无潜在肝功能异常的早期患者可以手术切除,然而绝大数肝癌患者,一旦明确诊断,却往往丧失手术机会,此外还有一部分患者,例如存在肝功能差、身体状况等因素,也不能进行外科手术。当前HCC治疗手段很多,发展也很快,除外科手术切除外,肝移植、局部消融、放射介入、新的分子靶向药物治疗以及姑息性对症治疗等都提供了选择治疗的手段,但是每一种治疗方法都有各自的适应症、禁忌症、独特的疗效和不良反应,因此,并不适合所有的患者。从改善患者生存率的角度,探求一种经济、简便、不良反应少的治疗预防靶向药物,一直是人们探寻药物治疗的方向和目标。熊去氧胆酸是一种无细胞毒性、亲水性的胆汁酸,其生理作用是改变胆汁成分,对胆汁酸有促进分泌作用,并溶解胆固醇,参与降低胆汁中胆固醇、胆固醇脂,用于不宜手术治疗的胆固醇结石,也是治疗原发性胆汁性肝硬化的一线用药。其药理作用是拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒作用,保护肝细胞膜；可促进内源性胆汁酸的分泌,减少重吸收；溶解胆固醇性结石；并具有免疫调节作用。八十年代以后,由于UDCA的细胞保护、利胆、免疫调节和抗氧化作用,应用于临床多种肝胆疾病。COPS5是COP9信号体的第5个亚单位,发挥正性调节蛋白的作用。研究表明,COPS5在HCC中表达显著高于癌旁肝组织及血管瘤旁肝组织。COPS5表达的上调可能在HCC的发生中起重要作用。COPS5也可以诱导肿瘤抑制因子p53从细胞核至细胞浆的转位,并促进p53的降解。肝细胞癌的生长和代谢与血管生长有密切关系,肿瘤血管生成与肿瘤生长浸润转移及预后有密切关系,近来研究证实某些肿瘤抑制基因失活与突变可导致肿瘤血管生成,p53的突变或失活与肿瘤血管生成有密切关系,p53为一抑癌基因,可以通过多种途径干预肿瘤的生长浸润,同时影响到肿瘤的预后。研究表明,UDCA可以减少结肠癌的发生,对乳腺癌细胞株也有诱导凋亡作用,可抑制化学致癌物对大鼠的致肝癌作用等。因此进一步探讨UDCA对肝肿瘤细胞凋亡和增殖方面的作用及其作用机制有重要意义。由于UDCA具有上述作用,那么UDCA是否能够通过COPS5和p53共同的作用机理而达到抑制肝细胞癌的作用值得我们探讨。UDCA在体内是否具有抗肝细胞癌作用以及可能的机制,仍需进一步探讨。为了验证这一设想,本课题将UDCA作用于SMMC-7721人肝细胞癌株及裸鼠移植瘤,观察UDCA体内外抗癌抑制作用,并通过观察其对COPS5和p53蛋白表达的影响,探讨其机制,为肝细胞癌治疗提供新的可能治疗方案奠定一定理论基础。第一部分UDCA对SMMC-7721人肝癌细胞株生长抑制作用的实验研究研究目的1、检测不同浓度UDCA对SMMC-7721细胞的生长抑制作用。2、检测不同浓度UDCA对SMMC-7721细胞中COPS5与p53表达的影响研究方法1、SMMC-7721细胞、L-02细胞冻存、复苏、培养、传代。2、Transwell迁移实验观察UDCA对SMMC-7721细胞的生长抑制作用。3、细胞免疫荧光实验检测JDCA对SMMC-7721细胞中COPS5与p53表达的影响4、蛋白免疫印迹法检钡UDCA对SMMC-7721细胞中COPS5与p53表达的影响结果1、Transwell迁移实验观察UDCA对SMMC-7721细胞的生长抑制作用(1) SMMC-7721与UDCA共培养48小时后,低剂量组计数细胞为7.42±0.14×105个/ml,高剂量组为5.16±0.10×105个/ml,对照组计数细胞11.89±0.24×105个/ml,显示UDCA对SMMC-7721抑制效应明显,差异有统计学意义(与对照组比较,P<0.001),而L-02细胞无显著差异(P>0.05)。(2)以对照组作为参照,计算实验组肝细胞株细胞数下降抑制程度与对照组比值,SMMC-7721低剂量组细胞抑制率为37.59±0.78%,高剂量组细胞抑制率为56.60±1。35%,高剂量组抑制率高于低剂量组,高剂量组与低剂量组比较有显著差异(P<0.01)；L-02细胞各剂量组无明显变化(P>0.05)。2、细胞免疫荧光实验检测UDCA对SMMC-7721细胞中COPS5与p53表达的影响(1)细胞免疫荧光实验结果显示,SMMC-7721细胞中COPS5主要定位于细胞核,胞浆中也可见部分表达,经UDCA处理后,其细胞核中荧光强度减弱,胞浆中较为分散。p53主要定位于细胞核,经UDCA处理后,其荧光强度较对照组显著增强。(2)计算两种蛋白的相对荧光强度,结果显示,与对照组比较,低剂量组、高剂量组中SMMC-7721细胞中COPS5:相对荧光强度分别为0.42±0.008、0.22±0.005均低于对照组(P<0.001),差异有统计学意义,随着UDCA浓度增加COPS5相对荧光强度呈减弱趋势。低剂量组、高剂量组中SMMC-7721细胞中p53相对荧光强度分别为1.26±0.023、1.34±0.031均高于对照组(P<0.001),差异有统计学意义,随着UDCA浓度增加,p53相对荧光强度呈增高趋势。3、蛋白免疫印迹法检测UDCA对SMMC-7721细胞中COPS5与p53表达的影响(1)随着UDCA浓度增高,COPS5的表达逐渐减弱,为进一步确定COPS5与p53表达情况,经计算机灰度扫描并与内参比较分析,0.4 mmol/L组相对值与对照组比较P<0.001,差异有显著性,1.0mmol/L组相对值与对照组比较P<0.001,差异有显著性。随着UDCA浓度增高,COPS5的表达呈减弱趋势。(2)随着UDCA浓度增高,p53表达逐渐增强,经计算机灰度扫描并与内参比较分析,0.4 mmol/L组相对值与对照组比较P<0.001,差异有显著性,1.0 mmol/L组相对值与对照组比较P<0.001,差异有显著性；结果提示,SMMC-7721细胞中随着UDCA治疗浓度升高,p53表达逐渐增强。结论1、UDCA可抑制SMMC-7721人肝细胞癌株的生长。2、UDCA作用SMMC-7721人肝细胞癌株的机制与调控COPS5与p53有关,可以通过上调p53表达,下调COPS5的表达,阻滞细胞增殖生长。第二部分UDCA对裸鼠移植瘤生长抑制作用的实验研究研究目的1、裸鼠移植瘤的制备2、检测不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。3、检测不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤组织的影响。4、检测不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤中COPS5与p53表达的影响研究方法1、SMMC-7721细胞冻存、复苏、培养、传代。2、制备二代裸鼠移植瘤模型。3、观察不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤生长曲线的影响。4、观察不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤组织坏死的影响5、免疫组化检测不同浓度UDCA对裸鼠移植瘤中COPS5与p53表达的影响。6、蛋白免疫印迹法检测UDCA对裸鼠移植瘤中COPS5与p53表达的影响。结果1、UDCA对裸鼠生长曲线的影响。UDCA能够明显抑制肝移植瘤的生长,治疗组肿瘤生长曲线为非指数生长,增长较缓慢,表现为随药物浓度增高抑制生长作用增强趋势。2、移植瘤组织病理学观察。移植瘤组织病理学观察结果显示,对照组瘤组织以轻度坏死为主,经治疗后,肿瘤坏死组织明显增加,UDCA高剂量组可见大片坏死组织,等级秩和检验X2=11.68,P<0.05,提示坏死组织与UDCA剂量有相关关系,全部实验裸鼠未见移植瘤远处转移情况。3、移植瘤组织COPS5、p53免疫组化结果光镜观察,对照组视野中可见细胞核呈棕黄色染色的肿瘤细胞,细胞形态不规则,经UDCA处理肿瘤组织,细胞核中COPS5棕黄色染色细胞数量减少,呈淡蓝色细胞核、细胞浆细胞数量较多,细胞形态较规则,而p53阳性细胞随UDCA浓度增高成增多趋势。4、Western blot检测结果经UDCA处理后,裸鼠移植瘤组织中COPS5与p53表达情况如下：随着UDCA浓度增高,COPS5的表达逐渐减弱,而p53表达逐渐增强。为进一步确定COPS5与p53表达情况,经计算机灰度扫描并与内参比较分析,90 mg/kg组相对值与对照组比较P<0.05,差异有显著性,270 mg/kg组相对值与对照组比较P<0.05,差异有显著性。结果提示,裸鼠移植瘤组织COPS5随着治疗浓度升高而减弱,而p53表达逐渐增强。结论1、UDCA可选择性抑制裸鼠移植瘤的生长。2、UDCA可促进裸鼠移植瘤肿瘤组织坏死。3、UDCA抑制裸鼠移植瘤生长的机制与调控COPS5与p53有关,可以通过上调p53表达,下调COPS5的表达,阻抑瘤细胞生长。4、UDCA可以预防实验性裸鼠肝细胞癌的发生。