背景:内地人进入高原往往会产生严重的高原反应。而在那里世代居住的少数民族已经由长期自然选择适应了高原环境,这种适应能力是可以遗传的。目前关于高原适应的研究多集中在以序列改变为基础的基因多态性引起的多等位基因方面,无论是习服理论还是需要长期自然选择的基因多态性理论都不能解释这些在胚胎期和婴幼儿期出现的高原适应性改变,近年来表观遗传学的新理论、新方法的出现为解释发育性适应提供了可能,基因的表观遗传学改变也可遗传,且已被证明同样是基因调节的重要方式。但胚胎期或者发育期高原低氧是否能够引起表观遗传的改变,导致机体对高原的长期适应目前国内外未见相关报道。有研究发现缺失DNA甲基化酶的一种结核杆菌比其他组死亡速度加快,即DNA甲基化酶在低氧适应过程中可能起到重要的作用,而DNA甲基化在高原适应的表观遗传学研究中的意义尚未见报道,我们决定从甲基化差异入手探寻高原适应在基因水平上新的机制,这在高原适应的表观遗传学研究中尚属首次。方法:1.MS-RDA法优化:甲基化敏感的代表性差式分析(Methylation-Sensitive Representational Difference Analysis,MS-RDA)是通过基因组消减杂交方法来筛选不同来源的两个基因组中差异甲基化片段的重要方法,经典MS-RDA法经过酶切和回收后需要更换好几次DNA接头,且步骤繁琐,这样降低实验的效率因而需要的样本量比较大(每次实验需10μg)。为此,我们根据一种先分别运用含d UTP的d NTP以及含d TTP的d NTP混合物进行PCR扩增,将扩增子杂交后再使用UDG酶和S1核酸酶切割双链驱赶子DNA以及驱赶子和检测子DNA杂交体的方法对传统的MS-RDA进行了改良,大大简化实验程序,降低了样本需求量并提高了获得差异甲基化DNA片段的机率。在进行正式实验之前,首先验证了改良的MS-RDA方法的特异性,将完全相同的人脐静脉内皮细胞基因组DNA分别作为检测子和驱赶子进行实验排除出现假阳性的可能;为判断改良方法的灵敏性,在两份相同的脐静脉内皮细胞的基因组DNA样品中分别加入线性化的未用Hpa II甲基化酶处理(作为检测子DNA)以及经Hpa II甲基化酶处理的p UC19质粒(作为驱赶子DNA),随后进行后续实验并将得到的差异片段连接至pc DNA3-T载体,转化DH5a感受态细胞经LB固体培养基培养,挑取阳性克隆,进行序列分析。2.分子克隆方法优化:将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,在用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为检测T载体的可用性,分别将长度为312bp和1329bp的c DNA片段与其连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。3.世居高原人群特征性基因甲基化片段筛选:在证实了改良的MS-RDA方法的特异性和灵敏性之后,我们分别提取了五个世居高原的柯尔克孜族人血液的基因组DNA以及五个平原的柯尔克孜族人血液的基因组DNA,以高原柯族人的血液基因组DNA作为驱赶子(Driver),以平原柯族人的血液基因组DNA作为检测子(Tester),用改进后的MS-RDA法进行实验,将得到差异片段切胶回收后按照优化过的连接方案连接我们自己构建的pc DNA3-T载体并转化测序,将测序结果进行BLAST分析及人类基因组定位分析。结果:1.改良MS-RDA方法:对改良的MS-RDA方法特异性分析表明,两组相同DNA进行酶切、扩增、杂交、消化、扩增等步骤后没有得到差异化条带,表明本方法具有很好的特异性;在相同的基因组中分别加入甲基化差异的DNA再运用改良的MS-RDA方法实验,结果得到了特异的差异条带,对条带进行序列分析,结果完全符合预期,说明经改良后的MS-RDA方法具有很好的灵敏性。2.基于Xcm I识别序列的T载体的构建及其与PCR片段连接的条件优化经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。3.运用改良的MS-RDA法对五对高原和平原的柯尔克孜族血液基因组DNA样品进行实验,共获得差异片段11条,其中5条编码序列被GENBANK收录,均位于线粒体上,片段两端位点确实具有Hpa II酶切位点,其中2条为编码COX1片段,3条为编码NADH还原酶2、4和5的序列。结论:建立了改良的MS-RDA方法,该方法具有很好的特异性和灵敏性,该方法是筛选差异甲基化基因的一种比较好的方法;基于Xcm I识别序列的T载体的构建及其与PCR片段连接的条件优化克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等条件的限制,可为常规的实验室容易的制备T载体并进行高效地连接提供了高效的途径;运用改良的MS-RDA方法发现了在世居高原和平原柯尔克孜族人群血液基因中甲基化水平差异的DNA片段。对得到的11条差异的DNA片段进行克隆、序列分析并BLAST分析后发现有五条被Gen Bank收录的差异片段,其中两条为在线粒体基因组中编码的COX1的序列,三条为编码NADH脱氢酶的序列。从甲基化差异入手,研究高原人群和平原人群的差异,找到差异位点对应的功能基因,可以为下一步高原医药学研究开辟新的方向。