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纽兰格林-1降低阿霉素所致的乳鼠原代心肌细胞自噬目的：研究报道阿霉素所致的心脏毒性呈累积性和剂量依赖性。发生心肌损害的癌症患者预后一般不好,尤其在最后一次应用阿霉素后4周以内发病的患者,约在确诊心肌病后2周以内死亡。目前已有大量研究表明自噬在阿霉素所致心肌病和心力衰竭中起着加快疾病进展的作用。卢等于2009年首次发现自噬水平异常增高在阿霉素所致心肌损伤中起着重要作用,使用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)能抑制自噬水平,明显改善阿霉素所致心肌病动物模型的心功能。之后人们对如何调控阿霉素引起的心肌细胞自噬进行了一系列探讨,发现通过在心肌细胞过表达GATA-4,可以抑制自噬相关基因Beclin1的表达水平,而上调抑制细胞凋亡的凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平,达到抑制阿霉素所致心肌细胞自噬,改善心脏功能的目的。上述数据均表示当使用阿霉素处理心肌细胞时,自噬可作为一种促死亡机制产生作用。因此调控自噬有可能成为防治阿霉素所致心肌损伤的新的研究靶点。纽兰格林-1(neuregulin-1, NRG-1)基因至少编码15种以上的同型异构体。而这些同型异构体在不同的组织器官具有不同的生物活性。而到目前为止,在不同的科学研究中使用了不同的NRG-1同型异构体。RhNRG-1是目前唯一一个在心力衰竭患者中验证了安全性和有效性的NRG-1相关的药物制剂。研究报道rhNRG-1改善阿霉素所致心肌病大鼠的心功能和预后,但其潜在的分子机制仍不明了。因此本实验旨在通过模拟体内阿霉素所致心肌细胞损伤环境,建立阿霉素诱导的心肌细胞自噬模型,观察自噬在rhNRG-1保护阿霉素所致心肌细胞损伤中的作用,并进行相关信号通路的分析和机制探讨。方法：分离并培养1-2天Sprague-Dawley大鼠原代心肌细胞,将细胞随机分为正常组、阿霉素组(1μM)、rhNRG-1组(1μg/ml)、PI3K抑制剂LY294002组(10μM)、NAC组(50μM)、Bcl-2siRNA处理组。转染GFP-LC3质粒检测细胞自噬水平。蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的水平,凋亡相关蛋白Bcl-2水平以及Akt总蛋白及其磷酸化水平。利用荧光探针DCFA-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。结果：本实验结果表明rhNRG-1可以抑制阿霉素所致的细胞自噬和细胞内ROS水平,升高凋亡相关蛋白Bcl-2的水平,与抗氧化剂N-acetylcysteine (NAC)取得的效果大体一致。在应用阿霉素的背景下,rhNRG-1可使蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平显著升高。与rhNRG-1相比,加用磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)抑制剂LY294002可使Akt的磷酸化水平下降,自噬和细胞内ROS水平升高,Bcl-2表达水平下降。转染Bcl-2siRNA(Bcl-2的小分子干扰RNA)的心肌细胞中rhNRG-1对自噬的调控作用被抑制。结论：Bcl-2介导rhNRG-1对自噬水平的调节,而rhNRG-1对Bcl-2的调节是通过PI3K/Akt/ROS信号通路来实现的。NRG-1通过激活PI3K-Akt信号通路抑制阿霉素引起的心肌细胞凋亡目的：阿霉素是目前临床上应用最多也是最成功的一种高效、广谱的抗肿瘤药物之一,常用于治疗各种恶性肿瘤和白血病。像其他抗肿瘤药物一样,阿霉素就是一把双刃剑,在杀死癌细胞的同时也容易损伤机体组织的正常细胞。当阿霉素诱导心肌损伤达到一定程度时会发生不可逆性心肌病,最终导致心力衰竭,预后很差。经过几十年的研究和探索,人们发现阿霉素引起的心肌损伤与细胞凋亡密切的关系。动物实验证实,经过阿霉素处理的小鼠心肌组织中发现了凋亡的心肌细胞。更直接的证据是,对应用了首剂量阿霉素的肿瘤患者进行心内膜活检,取活检组织进行电镜分析,发现了心肌细胞凋亡的证据：线粒体肿胀,染色质聚集。Popelova等发现阿霉素治疗的辅助用药右雷佐生,之所以能够起到保护心脏的作用,根本原因是因为其能够完全抑制阿霉素所致的细胞凋亡及其相关信号分子,该药的抗凋亡能力比其抗氧化能力更强。这些证据提示我们可以通过药物来调控细胞调亡水平达到防治阿霉素所致心肌损伤的目的。NRG-1与心脏发育和功能维持有密切关系,研究报道)阿霉素可以降低体外实验中心肌组织NRG-1mRNA表达水平致使NRG-1/ErbB信号系统活性降低。rhNRG-1是目前唯一一个在心力衰竭患者中验证了安全性和有效性的与NRG-1相关的药物制剂。研究报道rhNRG-1改善阿霉素所致心肌病大鼠的心功能和预后,但其潜在的分子机制仍不明了。PI3K/Akt途径是调控细胞凋亡的关键信号通路。因此本实验旨在通过模拟体内阿霉素所致心肌细胞损伤环境,建立阿霉素诱导的心肌细胞凋亡模型,并假设rhNRG-1能通过PI3K/Akt通路抑制凋亡而保护阿霉素所致心肌损伤方法：分离并培养1-2天Sprague-Dawley大鼠乳鼠原代心肌细胞,将细胞随机分为正常组、阿霉素组(1μM)、不同浓度梯度rhNRG-1组(10ng/ml-1000ng/ml)、PI3K抑制剂LY294002组(10μM)。TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot.WB)检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、细胞色素C水平及Akt总蛋白及其磷酸化水平。结果：本实验结果表明rhNRG-1呈浓度依赖性升高阿霉素诱导的低水平心肌细胞活性。特别是1000ng/ml处理组效果最为显著。RhNRG-1可以抑制阿霉素所致的细胞凋亡(应加相关的结果)。在应用阿霉素的背景下,rhNRG-1使Akt的磷酸化水平显著升高。与rhNRG-1相比,加用PI3K抑制剂LY294002可使Akt的磷酸化水平下降,并且心肌细胞凋亡水平显著升高。结论：PI3K/Akt信号通路介导rhNRG-1抑制阿霉素所致的心肌细胞凋亡。