目的本研究选用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR)检测结直肠癌与毗邻癌旁组织中miRNA-221表达状况,并以CDKN1C/p57为进一步的研究对象,再以半定量RT-PCR和Western-blot分析CDKN1C/p57mRNA和翻译后蛋白的表达状况,探讨miRNA-221对结直肠癌中CDKN1C/p57表达的调控作用,并为结直肠癌发病机制和诊断治疗的研究提供新的思路。方法1、组织来源：34例结直肠癌及对照癌旁组织标本取自我院2008年9月至2009年5月间手术患者,均经术后病检证实。其中男性20例,女性14例；年龄32～74岁,平均(52.5±11.8)岁；结肠癌15例,直肠癌19例。癌旁组织取自距离癌肿5cm的肠黏膜,另切取距离癌肿10 cm以上肠黏膜作为正常对照。全部病例术前均未接受化疗或放疗。标本采集后迅速放至液氮中冷冻,-80℃保存。2、引物设计与合成：由GeneBank查找基因序列,使用软件Primer-Express2.0进行引物与探针的设计。内参照RNU6B上游引物为5’-CTC GCT TCG GCAGCA CA-3’,下游引物为5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’,扩增产物长96 bp; miRNA-221上游引物5’-CAG CAT ACA TGA TTC CTT GTG A-3’,下游引物为5’-CTT TGG TGT TTG AGA TGT TTG G-3’,扩增产物长73 bp。上述引物均由上海生工合成。3、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测：以miRNA-221及其调节的靶目标细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CDKN1C/p57作为进一步研究对象。取上述步骤提取的总RNA 3μg为模板,参照TaKaRa公司的RNA PCR Kit Ver3.0试剂盒说明书行RT-PCR检测。CDKN1C/p57引物序列(片段长度500bp)为：上游5’-CGT TCT TCT CGG GTG GA-3’,下游5’-CTG TAC TCA CTT GGCTCA-3’；内参照GAPDH引物序列(片段长度452 bp)为：上游5’-ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC-3’,下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。PCR反应条件为：94℃2min；94℃30 s、55℃30 s、72℃1min,30个循环；72℃10 min。取PCR扩增产物10μL行1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 g/L溴化乙锭),用美国Pharmacia Master Image紫外凝胶成像系统进行CDKN1C/p57 mRNA表达水平的半定量分析。mRNA相对含量=目的基因条带积分吸光度值／内参照GAPDH基因条带积分吸光度值。4、Real-time Q-PCR检测标本中miRNA-221表达：常规Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA,DEPC水溶解沉淀,核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter, USA)测定RNA浓度,根据RNA在A260nm/A280nm≥1.8及甲醛变性凝胶电泳28S、18S RNA条带比值≥1.5鉴定RNA纯度及完整性。取总RNA 1μg加入无菌蒸馏水12μL,混匀后72℃孵育5 min以打开RNA二级结构,随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构；在另一去RNase的PCR管中配置以下反应液：dNTP mixture 2.0μL、Rnase抑制剂0.5μL、miRNA-221逆转录引物0.5μL、RNU6B逆转录引物0.5μL、5 x buffer 4.0μL、M-MLV逆转录酶0.5μL(Promega公司)；配好后加入到刚才含总RNA的溶液中混匀,42℃孵育60 min,所得cDNA置于-20℃保存。构建miRNA-221和RNU6B的Real-timeQ-PCR反应体系：cDNA 5.0μL、Primers 1.0μL、SYBR Green荧光染料10μL、无菌蒸馏水8.0μL；反应条件：95℃变性10 min；95℃15 s、65℃30 s、72℃30s,共40个循环；循环结束后72℃延伸10 min,每个标本均作复管PCR反应,至少重复三次(试剂购自TOYOBO公司,PCR仪采用ABI PRISM(?)7300)。5、PCR产物的定量校正和判定分析：采用RNU6B作为内参照,用RNU6B的拷贝数作为校正基数,通过Light Cycler软件直接获得各样本中miRNA-221的Ct (cycle threshold)值,与同样本中RNU6B的Ct值相减,即获得该样本中miRNA-221的ΔCt值；由于以Real-time Q-PCR来检测RNA时,受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制,我们再以正常肠黏膜的ΔCt值作为校正,得出-ΔΔCT值,按目的基因表达量=2-ΔΔCT公式计算各样本中miRNA-221的确切含量。6、Western-blot分析：组织块经预冷PBS漂洗2次,置于冰冷裂解液(含150mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl[pH 7.6]、0.1% SDS、1% NP-40和蛋白酶抑制剂复合物)中研磨匀浆后超声破碎10 min,1000rpm离心10 min,弃去培养液,PBS清洗；再1000 rpm离心5 min,弃上清,PBS清洗：1000 rpm离心5 min,吸去PBS溶液,再根据细胞量加入相应的提取缓冲液,4℃轻摇15 min,收集裂解液到EP管中,14000 rpm离心15 min；取50μg,总蛋白行SDS-PAGE并原位电转印至PVDF膜；膜经封闭液(含20mmol/L Tris-HC1 [pH 7.6]、150 mmol/L NaCl、0.1% Tween-20和5%脱脂奶粉)处理后,与兔抗人CDKN1C/p57(稀释1：2000)和内参照GAPDH(稀释：1：10000)的多克隆抗体分别孵育,膜经漂洗后再与辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔二抗(稀释1：5000)反应,增强化学发光法(ECL)发光试剂显影得到蛋白印记条带。一抗,二抗均购自Abeam公司。7、统计学处理：实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示,采用配对设计两两比较t检验,以P<0.05为差异有统计学意义,所有操作均以SPSS 13.0统计软件完成。结果1、CDKN1C/p57的转录及翻译后产物：本实验首先对34例样本行半定量RT-PCR检测CDKN1C/p57 mRNA表达。其中4例结直肠癌标本中CDKN1C/p57mRNA较癌旁组织表达明显下降,在进行下一步实验前将这些病例予以剔除(图1),余下30例样本(CDKN1C/p57 mRNA在结直肠癌与癌旁组织表达差异无统计学意义)纳入后继研究。2、PCR产物的特异性：由于不同序列或长度的PCR产物在不同的温度下熔解,因此可观察到不同的峰值.当只有特异性的PCR产物形成时,在熔解曲线图中只可见单一的峰。Tm主要依赖于片段长度、序列组成、GC含量和反应中Mg2+浓度等因素。在本研究中,miRNA-221的PCR产物长73 bp,其对应的Tm为84.26±0.56℃,熔解温度均一,峰的形状也较锐利。3、MiRNA-221在结直肠癌组织较癌旁组织中表达明显上调(2.041±1.401 vs0.806±0.341),差异有统计学意义(P<0.01)。4、30例结直肠癌标本中CDKN1C/p57蛋白较癌旁组织表达明显下降(3.019±1.708 vs 0.972±0.316),差异有统计学意义(P<0.01)。MiRNA-221与CDKN1C/p57表达水平有负相关性(r2=0.9156,P<0.01)。5、MicroRNA-221表达与TNM分期及浸润深度相关(P<0.05)。结论1、MicroRNA-221在结直肠癌中表达水平显著高于毗邻癌旁组织。在对结肠癌组织行半定量RT-PCR检测CDKN1C/p57 mRNA含量时,发现11.8%(4/34)的样本中CDKN1C/p57 mRNA含量存在低表达,符合实验前提出的肿瘤细胞中存在母源等位基因甲基化印记缺失的设想,从而造成CDKN1C/p57 mRNA在转录前已经表达下调,而并非由于miRNA-221的基因沉默机制引起。2、对剩余样本进行半定量RT-PCR和Western-blot检测分别证实结直肠肿瘤组织与癌旁组织相比,CDKN1C/p57 mRNA表达水平差异无统计学意义,而蛋白产物表达量在结直肠肿瘤组织中明显下降。3、MicroRNA-221在结直肠癌中表达上调可能仅抑制CDKN1C/p57 mRNA的进一步翻译但不能将其根本降解,表现为CDKN1C/p57在mRNA水平结直肠癌组织和癌旁组织中差异无统计学意义,而蛋白质水平在结直肠癌组织中表达明显下降,肿瘤细胞可能通过niRNA-221介导的CDKN1C/p57转录后基因沉默而获得浸润转移能力。4、MicroRNA-221差异表达状况可为结直肠癌早期筛查、病理分期、指导治疗、复发检测提供临床应用价值。