背景与目的:胃癌是十分常见的消化系统恶性肿瘤之一。在我国胃癌发病率和死亡率都较高,而且由于其缺乏早期的特异性临床表现,不易察觉,导致通常诊断出的胃癌都已进入中晚期,发生了浸润和转移。目前,治疗胃癌主要是通过手术、化疗、放疗的方法,但是整体效果并不理想,转移率和术后复发率都很高,5年生存率低至20%～30%。胃癌的发病机理是众多基因长期突变积累,导致一系列基因表达及信号通路调节发生异常。所以,研究有关的基因在胃癌发生、发展过程中的作用及其调节仍然是胃癌发病机制基础理论研究的重要环节,这类研究对胃癌未来的诊疗及治疗方面新技术的开发有重要意义。ARHGEF28(Rho guanine nucleotide exchange factor 28),又称为:Rgnef、p190RHOGEF、RIP2,是一种蛋白编码基因,位于人类染色体5q13.2,315836bp,共含有44个外显子和45个内含子。由于基因的不同剪切方式,一共有十四种转录变异体,其中最长的一个转绿变异体mRNA共6351bp,ORF(开放阅读框)长5196bp,含有36个外显子。Rgnef基因是Rho鸟苷酸交换因子(RhoGEF)家族成员之一,它的分子结构中有一个与FAK(Focal Adhesion Kinase)的结合位点。FAK可以磷酸化Rgnef,进而调节RhoGTPase活性,这可能与癌的发生、发展具有密切关系。近年兴起的 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑系统,是从细菌和古细菌的防御系统发展而来的。其中Cas9(CRISPR-associated nuclease9)技术的使用最为普遍,它的原理是利用sgRNA使Cas9酶准确地在靶基因位点进行编辑。与之前的基因编辑技术相比,具有廉价、简单、特异性和效率更高的优势,可以实现靶基因的完全敲除,所以从发现以来迅速了生命科学研究最热门的技术。为了准确的研究Rgnef在癌发生、发展过程中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统建立了 Rgnef-/-SGC7901细胞系,再通过一系列细胞行为、命运检测方法初步评估该基因在胃癌发生、发展过程中可能扮演的角色。方法:1.以NCBI数据库分析Rgnef基因的相关信息,从不同的转录变异体中找到共同的ORF,分析ORF并选择合适的外显子,通过在线网站设计sgRNA。(网站一:http://crispr.mit.edu 网站二:http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-desig)2.合成的sgRNAs进行退火,用Bbs I对PX459质粒进行酶切以及胶纯化回收,之后构建针对Rgnef基因的Cas9载体。3.用构建成功的重组载体转染SGC7901,T7E1鉴定重组载体的活性达到25%以上,用嘌呤霉素筛选,再进行细胞单克隆化,测序后选择Rgnef+/-SGC7901以及 Rgnef-/-SGC7901 细胞克隆,最后以 Western blot 确认 Rgnef-/-SGC7901细胞克隆,扩大培养后冻存。4.用MTT、平板克隆法、损伤修复法、Transwell法、考马斯亮蓝染色法、扫描电镜法、流式细胞仪及DAPI荧光检测法,对WT、Rgnef+/-SGC7901以及Rgnef-/-SGC7901细胞系进行行为、形态等检测,评价Rgnef基因的作用。结果:1.成功构建了靶向Rgnef的sgRNA-Cas9载体,且T7E1实验结果表明该重组载体的活性达到了 25%以上。2.成功构建了 Rgnef+/-SGC7901 以及 Rgnef-/-SGC7901 细胞系。3.MTT、平板克隆法、损伤修复法、Transwell法、考马斯亮蓝染色法、扫描电镜法、流式细胞仪及DAPI荧光检测法结果提示Rgnef基因敲除后,细胞的增殖、迁移、侵袭及运动性都被显著抑制,细胞被阻滞在了 G1期,但是没有观察到明显的细胞凋亡。结论:利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建了 Rgnef+/-SGC7901 以及 Rgnef-/-SGC7901细胞系。与WT细胞相比,各实验结果表明:Rgnef可以明显促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及运动等细胞恶性行为,并且可以强化这些行为相关的微结构的发育,Rgnef基因可使癌细胞周期G1期加快,对癌细胞的凋亡可能没有明显影响。实验结果支持了 Rgnef在胃癌作为促癌基因的角色认定。本文也对该基因可能的信号通路进行了初步分析,关于它的具体通路调节作用还有待于进一步深入研究。