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牙齿的发育矿化是上皮和间充质相互作用的结果，研究表明，众多的基因参与了牙齿的发育矿化过程，包括生长因子及其受体、信号分子、转录因子和细胞外基质蛋白等。转录因子是一类可以通过与下游靶DNA结合，从而调控下游基因转录的分子，它们接受来自生长因子等方面的信号，再将这些指令具体地传递给直接执行功能的蛋白分子。cbfal是一种成骨分化特异性转录因子，可以诱导成骨前体细胞合成和分泌ALP、OC、OPN、BSP等矿化相关蛋白，向成骨细胞分化。最近国外学者发现cbfa1在牙齿发育过程有表达；基因敲出的小鼠不仅全身骨发育异常，还出现牙齿发育障碍，而且牙齿特异的成釉蛋白基因的启动子上也发现了cbfa1结合位点。本课题采用细胞培养、PCR、基因重组、基因转染、免疫组织化学、反义核酸等方法研究cbfa1在牙齿发育矿化中的作用，在牙乳头细胞中探讨几种生长因子对cbfa1的作用以及cbfa1对矿化相关基因转录的调控，从而在转录水平阐明牙齿发育矿化的分子调控机制，为进一步研究奠定基础。 首先我们从小鼠牙胚组织中成功地克隆到了小鼠cbfa1全部编码区，约1.7kb，进一步证实了cbfa1在牙胚组织中的存在；根据cbfa1的基因结构和读框，我们选取了其中一个含有部分runt结构域和核定位信号的约204bp的基因片段，采用基因重组的方法成功地构建了原核表达载体pRSETA-cbfa1（204），并通过对T7启动子有较好效果的大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达，结果获得了预计的约14KD的cbfa1融合蛋白，并用Ni-NTA柱亲和层析进行了初步纯化；纯化的cbfa1融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了滴度为1/28的多克隆抗体，采用免疫组织化学和western blot的方法证明了所制备的抗体是成功的，效价分别为1:400和1:1000，为进一步的研究奠定了物质基础。 第四军医大学博士学位论文4 随后我们采用自行制备的抗体对牙胚组织和体外培养的人牙乳头细胞进 行了免疫组织化学研究，发现：cbfal在帽状期牙胚中表达于内釉上皮、外釉 上皮、牙胚间充质和牙囊；在钟状早、中期牙胚，Cbfal表达于内釉细胞、成 釉细胞以及紧靠成牙本质细胞层的牙乳头细胞，在牙槽骨中呈强阳性表达：钟 状晚期，成牙本质细胞和成釉细胞分泌牙本质和牙釉质基质，。bfal在牙乳头 表达为阴性，成牙本质细胞层弱阳性，成釉细胞为阳性或强阳性，牙囊中成骨 细胞强阳性表达，牙囊细胞弱阳性表达。表明。bfal参与了牙胚发育过程，尤 其是在成牙本质细胞和成釉细胞分化中可能起着重要作用。体外研究表明，体 外培养的人牙乳头细胞没有。bfal基因和蛋白的表达，当采用脂质体法瞬时转 染构建的真核重组质粒pGDNA3七 后，细胞中出现了Cbfal基因和蛋白的 表达，为进一步稳定转染作好了准备。 由于体外培养的人牙乳头细胞不表达。bfal，而体内牙乳头细胞的表达出 现在紧邻成牙本质细胞层的下方，于是我们设计了体外稳定转染。bfal基因的 实验。将以构建好的含全部编码区的真核表达重组质粒PCDNA3七，用脂 质体介导转染牙乳头细胞，并用 G4进行多次筛选，获得了 3个抗性克隆， 经过基因水平和蛋白水平多种方法的验证，鉴定出1个抗性克隆能稳定表达 。bfal基因和蛋白，并对其进行了一系列研究。结果表明：转染cbfal基因后 牙乳头细胞的增殖能力减弱，而与矿化相关的有关指标增高，如。AMP：ALP。 OC等。Cbfal不仅可以上调ALP和OC的活性，还能诱导OPN、BSP、ON 和DMPI这些矿化相关蛋白的表达，但对牙本质特异性蛋白DSP的表达和其 编码基因DSPP无明显作用，对1型胶原的表达量也有所增加，但经图像分析 和统计学处理无显著性差异。这些结果表明，牙乳头细胞也是cbfal作用的靶 细胞，Cbfal可以诱导牙乳头细胞表达矿化相关的基因和蛋白，提示Cbfal在 牙乳头细胞分化为成牙本质细胞中起着非常关键的作用。 为了探讨几种生长因子对牙乳头细胞中。bfal的作用，我们采用RT－PCR、 WestCm blot和免疫组织化学的方法观察 BMPZ、TGF p；、FGFZ和 EGF四种生 D叩。tment Of印e。t。e De。t。时and砌咖加n闲J 风WU 第四军医大学博土学位论文5 长因子在牙乳头细胞中对cbfal基因表达、蛋白合成和蛋白表达部位的影响。 结果表明：200ng／llil BMPZ和 50gb的FGFZ刺激正常人牙乳头细胞6h后 cbfal的表达明显升高，而 20ng／llil和 40n归的 TGF p；作用 12 h能抑制稳定 转染Cbfal基因的细胞中cbfal InRNA的表达；EGF则对牙乳头细胞中Cbfal 的表达没有显著影响。