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目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以AE3为靶基因,设计构建siRNA表达质粒,进行测序鉴定,并检测该表达质粒对大鼠心肌样细胞系H9c2 AE3基因表达的影响,为进一步研究AE3基因在心肌细胞损伤及保护中的作用奠定基础。方法:1.设计具有短发夹结构的三条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒并进行序列测定。2.转染携带绿色荧光蛋白的pEGFP-N2质粒,荧光显微镜观察检测瞬时转染不同时相的转染效率,选择最佳时相用于后续瞬时转染靶基因表达抑制率的分析。3.利用构建成功的siRNA表达质粒,通过脂质体介导转染H9c2心肌样细胞,并通过RT-PCR、Western blot检测细胞中AE3 mRNA和蛋白的表达。结果:1.重组质粒转化DH5α菌株经氨苄青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。2.测序鉴定表明重组质粒中含有针对AE3基因的目的序列。3.将pEGFP-N2通过脂质体介导,转染H9c2心肌样细胞,分别于转染24 h、48 h、72 h后在荧光显微镜下观察转染效果,可见H9c2心肌样细胞胞浆内有绿色荧光,其中转染48 h的转染效率82±6%显著高于转染24 h的转染效率43±6% (P<0.01)和转染72 h的转染效率60±7% (P<0.05)。因此,按48 h最佳转染时间转染构建好的siRNA表达质粒。4. RT-PCR检测细胞中AE3 mRNA的表达水平,显示pSilencer-AE3-A可明显降低H9c2心肌样细胞中AE3 mRNA的表达。5. Western blot检测细胞中AE3蛋白的表达量,显示pSilencer-AE3-A,pSilencer-AE3-B,pSilencer-AE3-C转染的H9c2心肌样细胞AE3蛋白表达分别降低61%,48%,25%。结论:1.成功构建AE3基因siRNA表达质粒pSilencer-AE3-A,pSilencer-AE3-B,pSilencer-AE3-C。2.重组质粒pSilencer-AE3-A可明显降低H9c2心肌样细胞AE3基因在mRNA和蛋白水平的表达。