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本文以胶原蛋白水解物.明胶多肽为研究对象,研究各种组成的性质和特征,应用修饰和交联技术,制备琥珀酰明胶和京尼平交联明胶,通过动物实验考查这两类明胶血浆代用品的药代动力学、生物有效性和应用安全性等,对明胶改性工艺进一步优化,并对其中涉及的关键问题和科学原理进行了探索。主要内容如下:
1.明胶多肽成份分析:首先利用液相色谱/质谱联用法,结合多肽序列标签技术,从分子层次上研究了明胶的多肽类型、来源和特征,并在牛源明胶中识别出了40余种来源于牛Ⅰ型胶原蛋白的特征多肽；利用氨基酸柱前衍生化技术,研究了明胶的氨基酸基础组成和特征。在此基础上,利用明胶中的特征多肽和特征氨基酸,解决了多分散复杂明胶多肽在生物体内的清除率、半衰期和代谢规律的难以表征等关键问题。
2.适宜理化性质明胶多肽的制备:分别采用热降解、酶降解、超滤和有机溶剂沉淀等多种分离分级方法,以高分子量明胶初级原料为对象,系统研究了明胶在不同分离分级条件下的保留行为和规律,获取了具有适宜分子量、胶体渗透压和分子量分布接近正态分布的明胶产品。所获得的两种明胶数均分子量分别为28 kDa和15 kDa,并将其分别应用于不同类型的明胶血浆代用品的制备。
3.明胶血浆代用品的制备:以琥珀酸酐为修饰剂,制备琥珀酰明胶；利用凝胶过滤色谱-多角度激光散射-三硝基苯磺酸衍生法,建立了一种分析蛋白中自由氨基含量和修饰度的新方法。采用京尼平作为交联剂,制备京尼平交联明胶。分别考察了制备工艺中反应条件对产品组成和理化指标的影响,并对制备工艺进行了优化。理化性质分析结果表明,两类产品的胶体渗透压、粘度和凝固点等均达到体内应用要求。所制备琥珀酰明胶的胶体渗透压为33 mmHg(4％,w/v),修饰度为38％,数均分子量为25.4 kDa；所制备京尼平交联明胶胶体渗透压为29 mmHg(4％,w/v),数均分子量为28.5 kDa。
4.明胶血浆代用品的有效性评价:通过对实验大鼠、兔子的动物实验,进行了两类自制明胶血浆代用品的有效性评价。结果表明,所制备的琥珀酰明胶和京尼平明胶具有良好的扩容效果和应用安全性。两种产品均能使血压在短时间内迅速恢复,并在2 h内保持在正常水平(大鼠组平均动脉压>100 mmHg,兔子组平均动脉压>85 mmHg)。琥珀酰明胶和京尼平明胶半衰期分别为6.7±0.2 h和3.3±0.2 h。对比商品化血浆代用品,实验组动物的血细胞指标(红细胞、血小板和白细胞系统等)、血液流变学参数(红细胞聚集、变形指数,血细胞比容和全血还原黏度等)和组织切片(心、肝、。肾、脾、肺和脑部)观察等均无显著差异或异常。京尼平作为一种具有抗炎作用的交联剂用于新型血浆代用品,有望在获得较好的扩容效果的同时,抑制炎症反应的发生。