柿属植物DNA提取纯化检测技术体系的建立

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柿属(Diospyros spp.)植物为多年生木本植物,其叶片和其他组织中富含大量的多糖、多酚等代谢产物,使提取高质量的DNA比较困难。本课题以柿属植物为材料,对芽、嫩叶、成熟叶、老叶、组培苗、花、萼片、一年生韧皮部、果实及其加工产品柿饼等不同来源的组织器官进行基因组DNA提取,试图建立和完善一套不受时间以及取材部位限制的高质量DNA提取纯化检测技术体系。该技术的建立和优化将为植物种质保存、鉴定和评价奠定坚实的基础,也将为植物品种知识产权保护、基因文库构建、分子辅助育种和基因克隆重组、功能鉴定等的分子生物学下游实验提供技术支持。主要的研究结果如下: 1.用碱裂解法、氯化苄提取法、高盐低pH法、改良SDS法、改良CTAB法及试剂盒法等六种方法对前川次郎组培苗、芽、一年生韧皮部、嫩、叶、花、萼片、幼果、成熟叶、成熟果、老叶、柿饼等不同组织器官进行DNA提取,碱裂解法操作简易省时,但提取效果不佳,其结果的准确性和可靠性较差。另外几种DNA提取方法都在原有方法上作了一定的简化,提取到的DNA质量尚佳,OD260/OD280在1.66-1.78之间,能够用作PCR扩增,说明简化操作流程对DNA质量要求不是太高的PCR反应是可行的。 2.基于CTAB法对鄂柿一号、前川次郎、君迁子等3份材料进行了DNA提取纯化,结果表明:(1)不同时期采样对DNA产率影响很大,随叶片生长,DNA产率不断下降,成熟叶片DNA产率仅为幼嫩叶片的16.7-19.4%;(2)在苯酚氯仿法、高盐乙醚法、CTAB沉淀法等三种纯化方法中以高盐乙醚法效果最好,可酶切,能有效去除多糖污染,产率较高;(3)四种沉淀方法中,高浓度的盐溶液有助于去除多糖、多酚等杂质,相比单纯的乙醇或异丙醇沉淀获得更高质量的DNA。
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