基因枪介导Bt基因转化甘蔗的研究

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基因枪转化技术是由20世纪80年代末逐渐发展起来的一种基因转化的方法,它的最大优点是无明显的宿主限制,几乎适用于任何受体材料,另外它只需要简单的组织培养,不必要经过复杂的原生质体的制备和培养阶段,为植物基因转化工作提供了一种更为简化的手段。对于对农杆菌不敏感的单子叶植物来说,是一种较为理想的转化方法。 本研究采用含Bt基因和卡那霉素(Kn)抗性标记的pBIWIQ-5质粒作为转化载体,用碱裂解法将其从宿主中大量提取,经PCR检测证明质粒DNA上连接上外源基因后,对质粒DNA进行纯化,并调节其浓度至1μ.g/μl左右,通过CaCl2和亚精胺等试剂将其包被在钨粉表面,用GJ-1000高压气体基因枪将钨粉颗粒高速射入甘蔗胚性愈伤组织。转化后将受体材料置于M1培养基上恢复培养一个星期,以利于受轰击愈伤组织的恢复及外源基因的充分表达,再转到M2培养基上培养,待其形成新的愈伤组织后,将新生的愈伤组织转到M3上诱导成苗。培养约20天,胚性愈伤组织上开始分化出芽,而未转化的愈伤组织逐渐变褐死亡、成水渍状坏死或分化出白化苗,只有部分经质粒DNA轰击的愈伤组织能继续发育成胚状体,并能进一步发育成绿色的幼苗。待幼苗长到约2cm高的时候,将其转入生根选择培养基M4进行选择培养,部分幼苗能生根,并逐渐发育形成明显的根系,将幼苗移植到土中培养。 幼苗长到约20cm高的时候,取其新鲜的嫩叶0.2~0.5g,用SDS法提取总DNA,进行PCR检测和Southern杂交。结果表明,大部分抗性植株含有外源Bt基因;Southern杂交显示抗性植株出现了预期的杂交信号,证明外源基因已经成功整合到甘蔗的基因组中了。 此外,还讨论了基因枪介导甘蔗遗传转化的几个主要影响因素,对转基因技术在甘蔗育种上的应用进行了展望。
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