论文部分内容阅读
植物小RNA(sRNA)是一类长18-24nt的非编码RNA,它们参与调控植物的生长发育、生殖与基因组重组等生物过程,同时,小RNA也在植物响应非生物胁迫、增强植物耐受能力等方面起着非常重要的作用。干旱胁迫是植物最常遇到的环境胁迫,而植物的干旱响应是个复杂的过程。三七是我国人工种植历史悠久并且能规模化种植、经济价值极高的少数药用植物之一。随着全球温室效应的加剧,极端天气频发大背景下,研究干旱胁迫对三七生长及有效成分含量变化及相关机制,不但可以为三七生产提供优质栽培管理的科学依据,还可以拓展药用植物生理及次生代谢产物的研究内容。本文以期通过分析高通量测序数据,在三七中挖掘、验证由小RNA介导的干旱响应皂苷代谢调控通路基因,特别是合成四环三萜类化合物的上游萜类骨架合成的关键基因。为拓展对miRNA在次级代谢通路调控中的相关认识,并挖掘相关miRNA标记,为高品质三七育种奠定基础。本文主要有以下几个方面的研究成果。1、通过对干旱处理的三七叶和根进行转录组测序,采用STAR—Cufflinks对转录组进行数据分析,分别从叶和根中得到3539个和3179个表达量较高的基因,并分别对它们做基因时序性聚类分析,分别得到5个和2个表达趋势不同的基因类别。通过KEGG和GO聚类分析对这7个不同表达模式的基因进行分析,得到了响应干旱胁迫基因及其功能。在次级代谢通路中,重点分析了萜类骨架合成代谢途径和苯丙烷代谢途径,分别得到了叶中15个和根中13个干旱响应基因。而三七叶和根中分别各有149个和67个胁迫相关转录因子,其中有24个家族的成员是植物内源激素响应通路中重要的响应蛋白,以ABA和乙烯响应蛋白成员最多,且表达量随干旱时间增加而升高。可见,ABA和乙烯在三七干旱胁迫响应中具有重要的作用。2、通过对小RNA的高通量测序与数据分析,共找到1584个三七保守的miRNA,预测出保守miRNA前体结构256个,得到非保守miRNA及其前体198个。通过CleaveLand将这些miRNA进行靶基因预测后,共识别出保守miRNA的584个靶基因,非保守miRNA的254个靶基因,将这些靶基因进行SOM表达聚类分析后,将干旱胁迫下表达量发生变化的miRNA靶基因进行KEGG通路和GO功能分析,得到43个响应干旱胁迫且调控转录因子和具有胁迫响应功能的miRNA。将这些miRNA及其靶基因的表达量进行相关性分析后,得到8对具有显著负相关性的miRNA—靶基因。通过KEGG通路分析后,找到4对与萜类合成相关的miRNA—靶基因,它们是MIR156aaai—GGPS、MIR482g—ispF、t15589037—ispH和t49562107—HMGCS。这些miRNA可以作为筛选耐旱或高品质三七的标记。通过对三七基因组分析,识别到一个TAS3基因,既TAS3b(-),它产生的tasiRNA靶向两个ARF基因。表达量相关性分析显示TAS3b(-)、TAS3b_D5(-)和TAS3b_D6(-)与ARF的表达量呈负相关性,且随着干旱时间的增加,叶中的TAS3b(-)和TAS3b_D5(-)表达量上升,而ARF表达量下降。可见干旱胁迫下三七叶子激活TAS3基因以抑制ARF基因的表达。3、皂苷合成代谢中,萜类骨架合成通路是合成前体的重要过程。首先,通过短期(0-24 h)和长期的干旱处理(0-30 d)三七后,对所有这些基因进行了qRT-PCR实验。短期处理下三七叶和根qRT-PCR的实验结果与本研究预测到的基因表达情况相似,说明本研究预测的基因表达量较为准确。另一方面,采取长期干旱的处理,通过qRT-PCR的方法研究了萜类骨架合成相关基因表达量,发现除了PMK、MVK和CAS外,其余基因表达都成上升趋势。4、本研究将上述预测到的4个被miRNA调控的基因进行RLM-5’RACE实验,得到一个确定靶点的miRNA及其靶基因,既t49562107和HMGCS。得到t49562107和HMGCS的ORF全长序列后,构建t49562107前体—RFP和HMGCS—GFP报告载体质粒,转入到洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现转入两个质粒后洋葱的GFP信号会减弱,说明t49562107有抑制HMGCS的作用。综上所述,本研究首次通过分析干旱胁迫下三七叶和根的转录组、降解组和小RNA测序数据,找到40个响应干旱胁迫并参与调节相关转录因子和胁迫相关蛋白的miRNA,以及4个响应干旱胁迫且调节皂苷骨架合成代谢相关基因的miRNA,并确定了HMGCS基因的miRNA裂解位点。首次为miRNA作用于皂苷萜类骨架合成关键基因提供依据。本研究将为筛选抗旱和高品质三七育种研究奠定一定的基础。