单细胞分析研究是化学、生物学和医学等学科相互渗透发展形成前沿领域。细胞是生物结构和生命活动的基本单位,要探索生命的本质并阐明生命活动过程,必须以细胞为对象,深入研究细胞的生长、分化、代谢、运动、衰老、死亡、遗传和进化等生命活动的基本过程。长期以来,由于检测方法灵敏度的限制和单细胞分离分析方法的缺失,人们只能通过细胞群体的分析,获取细胞的各种信息,而从中得到的的细胞统计平均结果必然会掩盖单个细胞之间的差异,使生物学及医学等很多领域的发展受到限制,而单细胞水平的研究则可以为其提供更为丰富和准确的个体信息,避免了单细胞的差异性被大量的背景信号覆盖。随着研究的深入,人们逐渐理解单细胞分析对个体健康的重要性,在癌症的早期诊断、治疗以及预后检测等临床应用中,通过单细胞测序分析方法能够更加深入阐明癌组织中遗传物质的变化从而准确的预测癌症发生原因以及癌组织的变化,为癌症的治疗提供更为准确的治疗方案。目前,单细胞测序技术已经广泛的应用于微生物、神经学、人体发育、免疫、癌症、辅助生殖等领域的研究。随着2016年一项大型国际合作项目“人类细胞图谱计划”（Human Cell Atlas Project）的提出,单细胞研究分析被推向了一个新的高潮。开展单细胞研究的最关键之处在于如何对大量细胞进行有效的分离并进行后续的分析应用,如单细胞生长异质性研究、单细胞蛋白组分析、单细胞转录组分析、单细胞基因组分析等,并将其关联在一起绘制细胞图谱。微流控芯片平台因其体积小、试剂消耗少、通量高、成本低、生物相容性好、可高度集成生物分析中需要的不同试剂处理功能等优点,使得其特别适合应用于高通量单细胞的研究。尽管微流控技术在单细胞分析研究中已经初步的展现出巨大的发展前景和应用潜力,如液滴式微流控法（Dropseq,10×Genomic公司高通量单细胞测序平台）和芯片微流控法（Fluidigm公司推出C1系统）,但也因其方法的特点导致细胞损失率高,无法对稀有细胞进行有效的分析。针对上述问题,本论文展开了以下几个方面的研究:一、基于微流控技术的高通量单细胞捕获和三维培养随着单细胞研究的逐渐广泛和深入,基于微流控平台的单细胞研究也越来越多,但现有的单细胞分析平台进行单细胞分离分析主要基于两种原理,一种是利用极限稀释法实现单细胞的分离与研究,细胞的分布符合泊松分布,细胞损失大,无法实现稀有细胞的分离分析;另一种则是基于流体力学的单细胞分离与捕获,但目前已发表的文章中,基于流体力学方式进行单细胞分离都无法避免单细胞之间微环境的相互干扰,无法形成独立的反应腔体和无干扰的单细胞三维培养分析。为解决上述提出的问题,我们设计了一种基于流体力学的微流道结构,能实现高效的单细胞捕获与分离,不同的单细胞被隔离在单独的反映腔体内,相互之间无干扰。利用该芯片,我们以K562为模型细胞,研究了不同个数细胞（40-800个细胞）的捕获,统计其捕获效率,均在80%以上,证明该芯片对少量细胞具有非常高的捕获效率;同时,我们利用该芯片实现了五种不同种类细胞的高效捕获分离,证明该芯片对于不同单细胞的捕获具有非常好的适用性。我们将该单细胞捕获的微流控平台与具有温敏特性的低温琼脂糖结合,实现了单细胞三维长期培养。该平台的建立与稳定为后续单细胞分析平台提供了强有力的理论和实验基础,并有望为临床医学的药物筛选、临床治疗等提供高效的研究平台和治疗指导。二、一种新型的基于微流控的单细胞操控平台液滴微流控平台与微阵列芯片平台应用于单细胞检测分析是目前单细胞研究的两大主流平台。液滴微流控技术可以通过控制流体流速方向以及外加力场,例如电场、磁场、声波、压力等实现液滴的微操控如生成、融合、混匀、分裂、贮存等,但是由于液滴在隔离相处于随机分散,无法固定,可能发生随机的漂浮和移动,无法实现长期动态的观察和洗涤、换液等微操作;与微液滴技术相比较,微阵列芯片的每一个微腔体位置固定,更易于观察对象的长期观察和原位跟踪,但是它缺少了液滴微流控技术灵活的操作性。本文结合了液滴微流控技术通量高可微操控的特点和微阵列芯片可原位观察的特点,设计了按照阵列排列的微反应腔体,并结合流体力学特征设计微流道快速进行微粒的配对捕获和包含微粒的液滴的快速生成,通过双层芯片的设计和泵阀结构的融合,利用外加力的微操控实现配对液滴的融合、混匀、反应液替换等等功能的微流控平台。利用该平台,我们进行单细胞单细胞配对实验的可行性,为细胞共培养提供理论基础。通过实现单细胞单微球配对捕获和芯片上可控的细胞长期孵育、反应液替换、单细胞可控裂解等微操控验证为后续单细胞检测、单细胞药物研究、单克隆筛选体系、分泌蛋白和胞内蛋白检测及单细胞测序平台的建立提供理论基础。三、高通量单细胞mRNA测序平台建立随着高通量测序技术的快速发展,人们已经能够在单细胞水平对肿瘤细胞进行遗传突变和基因表达的准确检测。尤其是单细胞测序技术（Single Cell Sequencing,SCS）的出现,使得对肿瘤单细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学进行全面、精准的研究成为可能。制备单细胞测序文库首先面对的难点是获取高质量的单个细胞,而目前现有的单细胞分离制备测序文库的微流控平台均无法实现稀有珍贵细胞样品的自动化测序样品制备,普遍存在细胞样本损失大的问题,只能依靠耗时耗力的显微操控才能实现。基于此,我们利用实验室已经发展的配对芯片原理,通过不断地优化改进,实现了少量细胞和编码微球的高效快速配对捕获,并结合编码微球的编码技术与微流控的微操控,实现一次实验对上千单细胞进行编码,并开展了转录组分析,实现大量单细胞转录组测序样品的快速自动化制备,测序样品和试剂消耗量大大减小,成本低,通量高,可操控性强。