神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor,NET)是一组起源于弥散神经内分泌系统的异质性肿瘤,可发生于全身多个部位,其中胃肠胰NETs(GEP-NET)约占65%~75%。多个国家以及地区的流行病学调查结果显示GEP-NET的发病率呈稳定上升态势,其患病率在所有消化道恶性肿瘤中仅次于结直肠癌而居于第二位。本病症状复杂多样,可由良性逐渐发展成恶性,病程缓慢,而且易与内分泌等相关疾病相混淆,加上缺乏准确有效的检查手段,误诊和漏诊常见。目前对于GEP-NET,手术切除是最主要的治疗方法,药物治疗可应用细胞毒性药物、生长抑素类似物等缓解症状,抗血管生成及抗生长因子的靶向治疗是新的治疗方法。m TOR是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,调控细胞生长、增殖、分化、凋亡、自噬以及细胞周期等多个方面。目前用于治疗的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1)特异性抑制剂依维莫司可显著抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡,表现出显著的临床疗效。但实际上GEP-NET患者对依维莫司治疗的反应不一,其机制尚未完全阐明。恶性肿瘤的快速生长需要充足的营养和能量,其供给方式主要包括糖酵解、谷氨酰胺依赖的合成代谢和脂肪代谢等。恶性肿瘤的一个重要特征就是细胞的能量代谢异常,肿瘤在其发生发展过程中常伴随着代谢途径的重塑。临床上我们发现近50%的胰腺神经内分泌肿瘤PET-CT检查表现为阴性,同时分级越高,PET-CT检查阳性率越高。提示我们部分GEP-NET存在代谢方式的多样性而并非以糖酵解为主。近年来相关研究表明mTORC1的激活与营养、能量信号等有关,但和谷氨酰胺代谢鲜见报道。在本研究中,我们发现神经内分泌肿瘤组织标本中高表达谷氨酰胺酶1型(GLS1)和m TORC1相关蛋白Raptor,体外实验发现人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株BON-1的生长明显依赖于谷氨酰胺代谢,mTORC1抑制剂可以影响GLS1的表达从而影响谷氨酰胺代谢进而抑制细胞增殖。本研究初步探讨了mTORC1信号通路参与的细胞能量代谢,为胃肠胰神经内分泌肿瘤的治疗提供新方向。实验方法第一部分(1)westernblot检测人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株bon-1中代谢相关酶表达水平;(2)选取胃肠胰神经内分泌肿瘤临床组织标本,利用免疫组化检测糖酵解和谷氨酰胺代谢关键酶ldha、pkm2、slc1a5、gs、got2、gls1、gls2的表达,同时检测不同分级的组织标本中mtorc1及mtorc2通路中相关蛋白raptor、rictor的表达情况。第二部分(1)体外培养人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株bon-1,分别剥夺葡萄糖和谷氨酰胺,cck-8检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;(2)干扰bon-1细胞gls1表达,检测细胞增殖及克隆生长情况;(3)在剥夺谷氨酰胺的培养基中加入谷氨酸(glu)后检测细胞生长情况;(4)mtorc1抑制剂处理bon-1细胞,用westernblot检测gls1蛋白表达水平及胞内谷氨酰胺水平,采用cck-8检测细胞生长情况。结果:1、神经内分泌肿瘤组织标本和细胞系中代谢相关酶的表达情况(1)westernblot检测人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株bon-1中代谢相关酶表达水平发现谷氨酰胺代谢相关酶gls呈高表达;(2)在胃肠胰神经内分泌肿瘤组织标本中,免疫组化结果显示谷氨酰胺相关代谢酶gls1相对于癌旁组织为高表达;(3)gls1的表达情况和ki67分级呈负相关趋势;(4)在约90%(27/30)的神经内分泌肿瘤组织标本中,免疫组化结果提示肿瘤组织中raptor相对于癌旁组织表达呈强阳性;(5)rictor在神经内分泌肿瘤组织标本中呈阴性或弱阳性表达,在各分级中表达无明显差异。2、mtorc1通路调节gls1介导的谷氨酰胺代谢(1)体外培养人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株bon-1,分别剥夺葡萄糖和谷氨酰胺发现剥夺谷氨酰胺后细胞生长速率明显减慢,细胞生长周期明显受到阻滞,凋亡增加;(2)干扰bon-1细胞中gls1表达,细胞增殖和克隆生长能力下降;(3)在剥夺谷氨酰胺的培养基中加入谷氨酰胺的代谢产物谷氨酸后可以回复细实验方法:胞生长;(4)mTORC1特异性抑制剂处理BON-1细胞后,Western Blot检测GLS1蛋白表达水平下降,胞内谷氨酰胺水平升高,同时抑制细胞生长。结论:mTORC1信号通路在胃肠胰神经内分泌肿瘤中常常是激活的,人胃肠道神经内分泌肿瘤细胞株BON-1明显依赖于谷氨酰胺生长,m TORC1特异性抑制剂通过影响谷氨酰胺分解代谢关键酶GLS1的表达从而影响谷氨酰胺代谢,进而抑制肿瘤细胞增殖。