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高等植物能通过有氧代谢把氧气还原成水,为植物生长发育各环节提供能量。当还原过程不完全时,就不可避免的会产生活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)。尽管科学家发现微量ROS在植物的正常生长代谢中能起到积极所用,但过量的ROS积累仍会伤害生物的正常生长,比如致使蛋白质、膜脂或其它的细胞组分损伤,引起细胞的程序性死亡,改变根毛发育情况,造成雄性不育等。线粒体磷酸转运体(Mitochondrialphosphate transporter/Phosphate Carrier, MPT/PiC)位于线粒体内膜上,主要功能是将重要代谢底物无机磷酸(Pi)从细胞质中转移到线粒体基质。已经证明,拟南芥MPT家族共有三个成员,其过表达株系对盐胁迫超敏感,但是人们对于植物MPT与ROS的关系以及MPT对生长发育的影响机制仍不是很清楚。
植物在生长发育过程中,会遇到如土壤盐害、干旱、低温等各种不利的外部环境。伴随着多种生物及非生物胁迫的影响,呼吸作用和光合作用都会有所减弱,出现能量不足,从而引起一系列生理、代谢和分子水平上的事件发生。已经证明,拟南芥的三个MPT成员可以通过影响ATP的合成以及赤霉素的代谢来调控植物的盐胁迫响应途径,但是人们对于植物MPT与渗透胁迫的关系仍不是很清楚。
本实验以超表达拟南芥AtMPT3植株为材料,探讨AtMPT3对植物生长发育的影响以及与渗透胁迫的关系,为揭示AtMPT3的生物学功能提供依据。主要研究结果如下:
(1)通过对编码蛋白的疏水结构和三级结构的分析表明,AtMPT3蛋白具有线粒体磷酸转运体的基本结构特征,即有六个α螺旋组成的跨膜结构域,其中每两个形成一个串联结构,共有三个串联的重复结构,它们之间被一个亲水的膜外环隔开。这种跨膜结构域对于在线粒体内膜上定位起重要作用,在线粒体的转运蛋白中是高度保守的。
(2)对AtMPT3表达模式进行分析表明,AtMPT3在拟南芥的不同生长阶段和不同组织中均有表达,且在叶片中水平较高,在花粉中也有一定表达。说明AtMPT3在拟南芥的生长发育过程中发挥作用。
(3) AtMPT3超表达株系在正常生长条件下表现发育异常表型,如生长弱小、叶片短小卷曲且呈深绿色、花序呈大头针型以及花粉失活等,并且在细胞水平上发现大量的细胞死亡现象,表明AtMPT3对拟南芥的生长发育有重要作用。
(4)通过对超表达株系以及野生型进行基因芯片比较分析发现,AtMPT3表达量的上调使拟南芥体内多个生物学过程发生了改变。其中,活性氧调控及电子传递链相关基因的表达受AtMPT3超表达的影响极为明显。
(5)利用组织染色以及qRT-PCR的方法,分别从细胞水平和分子水平上证明了AtMPT3超表达株系中活性氧水平高,积累过量,与芯片分析结果一致,表明AtMPT3表达水平的高低可能影响植物体内细胞的ROS代谢。
(6) AtMPT3超表达株系的呼吸测定结果表明其线粒体电子传递过程并没有受到阻碍,说明ROS的过量积累并不是呼吸受阻造成的。
(7) AtMPT3表达受到渗透胁迫的明显诱导,超表达株系对渗透胁迫处理敏感。分析发现,渗透胁迫处理后,超表达植株体内呼吸速率明显加快,ATP含量提高。并且敏感表型能够被ATP合成抑制剂互补恢复,说明ATP是调控拟南芥渗透胁迫耐性的重要调节因子。