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背景和目的:神经母细胞瘤是婴幼儿中一种常见的恶性肿瘤,其特点为具有较强的转移能力,也是其死亡率居高不下的主要原因。尽管神经母细胞瘤具有多种治疗手段,再发或转移的神经母细胞瘤患者仍然具有极差的预后,伴随着不到40%的生存率。到目前为止,神经母细胞瘤的发生、发展、转移的分子机制尚不十分明确。因此,探究针对神经母细胞瘤的新的治疗靶点,以期提高预后仍是非常必要的。miRNAs作为一组内源性单链非编码RNA片段,其长度约18-25个核苷酸,这类非编码RNA在肿瘤形成和进展中发挥关键的调控作用。近期研究表明,这些miRNAs可以通过不完全的碱基互补配对与靶基因3’-UTR或者编码区结合,从而抑制靶基因翻译成蛋白质或者直接降解靶基因mRNA片段。这些数据表明,miRNAs可作为诊断肿瘤的生物标志物并发挥其致癌或抑癌的作用。据报道,许多miRNAs,例如miR-26a,miR-27,miR-92,miR-338-3p等等,参与了神经母细胞瘤的生长、转移等过程。既往研究表明,miR-34a参与多种肿瘤的发生发展过程。虽然近年来miR-34a已得到广泛研究,然而它在神经母细胞瘤发生和发展中的功能以及分子机制仍知之甚少。本课题包括以下三部分:第一部分:miR-34a调节小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的相关研究;第二部分:miR-34a靶向调节ATG5的相关研究;第三部分:ATG5逆转miR-34a调控神经母细胞瘤细胞功能的机制研究。第一部分miR-34a调节小儿神经母细胞瘤细胞增殖、转移和自噬的相关研究方法:1.通过qPCR的方法分别检测miR-34a在神经母细胞瘤组织和细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)中的表达水平,并分析其表达量与患者临床病理特征、生存率的相关性。2.通过MTT实验检测过表达或抑制miR-34a对神经母细胞瘤细胞增殖的影响。3.细胞克隆实验检测过表达或抑制miR-34a对神经母细胞瘤细胞克隆的影响。4.Transwell法检测miR-34a对神经母细胞瘤细胞迁移、侵袭的影响。5.定量分析miR-34a表达量对GFP-LC3阳性细胞百分比以及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白)表达量的影响。结果:1.神经母细胞瘤组织以及细胞系中miR-34a的表达水平显著下调,并与患者肿瘤分级相关。2.miR-34a表达量上调显著提高神经母细胞瘤患者的生存率。3.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖、克隆,抑制miR-34a表达促进SK-N-SH细胞的增殖、克隆。4.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的迁移、侵袭,抑制miR-34a表达促进SK-N-SH细胞的迁移、侵袭。5.miR-34a过表达降低GFP-LC3阳性细胞百分比,抑制miR-34a表达增加GFP-LC3阳性细胞百分比。6.miR-34a过表达抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平,增加p62蛋白水平;抑制miR-34a的表达增加神经母细胞瘤SK-N-SH细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平,降低p62蛋白水平。第二部分miR-34a靶向调节ATG5的相关研究方法:1.通过生物信息学分析推测miR-34a的靶基因。2.构建野生和突变型的ATG5 3’-UTR的重组质粒,通过双荧光素酶报告和RIP实验验证miR-34a的靶基因。3.通过qPCR检测ATG5在神经母细胞瘤组织和细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)中的表达水平,并分析其与miR-34a表达量的相关性。4.通过Western blot检测miR-34a过表达和敲减后ATG5的表达。结果:1.生物信息学预测显示ATG5为miR-34a的靶基因。2.双荧光素酶报告基因和RIP实验验证ATG5为miR-34a的靶基因。3.ATG5在神经母细胞瘤组织和细胞系中表达量上调,且其表达量与miR-34a成线性负相关。4.miR-34a过表达可以抑制神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中ATG5的表达;敲减miR-34a促进SK-N-SH细胞中ATG5的表达。第三部分ATG5逆转miR-34a调控神经母细胞瘤细胞功能的机制研究方法:1.通过Western blot检测miR-34a模拟物与过表达ATG5或anti-miR-34a与siRNA ATG5共转染对ATG5表达水平的影响。2.通过MTT检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)增殖活性的影响。3.通过克隆形成实验检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)克隆形成的影响。4.通过Transwell实验检测回复ATG5的表达量对神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)迁移、侵袭的影响。5.通过定量分析以及Western blot检测GFP-LC3阳性比例以及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62)的表达水平。结果:1.过表达miR-34a和ATG5共转染显著增加SH-SY5Y细胞中ATG5蛋白表达量;敲减miR-34a和ATG5共转染显著降低SK-N-SH细胞中ATG5蛋白表达量。2.回复ATG5的表达量显著逆转miR-34a对神经母细胞瘤细胞增殖、克隆、侵袭、迁移、自噬的抑制作用。结论:1.miR-34a在神经母细胞瘤中表达量下调,与临床肿瘤分级相关。2.miR-34a表达量上调显著提高患者的生存率。3.miR-34a过表达可以抑制神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y细胞、SK-N-SH细胞)增殖、克隆、侵袭、迁移、自噬。4.ATG5为miR-34a的直接靶位基因。5.ATG5在神经母细胞瘤中表达量上调,与miR-34a的表达量呈负相关。6.miR-34a通过调节ATG5发挥其对神经母细胞瘤细胞恶性生物学特性的抑制作用。