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第一部分联合应用前交叉韧带切断术和卵巢切除术建立大鼠骨关节炎模型的实验研究目的:评价卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合前交叉韧带切断术（Anterior cruciate ligament transection,ACLT）建立大鼠绝经后骨关节炎（Osteoarthritis,OA）模型的有效性,为绝经后骨关节炎的相关基础研究提供理想的动物模型。方法:1.48只12周龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠被随机分为4组:sham组,ACLT组、OVX组和ACLT+OVX组,每组12只,各组又分为病理学观察亚组和影像学分析亚组,每个亚组6只。ACLT组接受右膝ACLT手术,OVX组接受双侧OVX手术,ACLT+OVX组同时接受ACLT和OVX手术,sham组接受假手术操作。2.造模8周后,收集所有大鼠的右膝关节标本,对影像学分析亚组标本的胫骨平台软骨面进行宏观评分后置于75%乙醇中固定,然后应用微型CT（Micro-computed tomography,micro-CT）进行软骨下骨的检测分析。病理学观察亚组标本经固定、脱钙、包埋和切片后,采用甲苯胺蓝染色法进行染色,然后应用国际骨关节炎研究协会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）评分法进行评分以评价软骨退变情况。结果:1.宏观评分结果:sham组胫骨平台关节面光滑有光泽,关节囊结构正常。OVX组的关节面基本光滑,但色泽略暗。ACLT组的内侧胫骨平台软骨面表层可见软骨侵蚀,光泽度变差,呈浅灰白色,周围关节囊和软组织可见肥厚增生。然而,ACLT+OVX组的软骨损伤程度更为严重,侵蚀达软骨深层,残面呈灰白色,色泽差,表面可见溃疡面,周围关节囊组织增厚明显。宏观评分结果显示ACLT组的评分显著高于sham组（P<0.005）,但低于ACLT+OVX组（P<0.005）。OVX组和sham组的评分差异不明显（P>0.05）。2.甲苯胺蓝染色及OARSI评分结果:甲苯胺蓝染色结果显示,sham组的关节软骨表面光滑,结构层次清晰,软骨细胞排列规整,基质着色均匀,潮线结构清晰,半月板形态正常。OVX组软骨表面可观察到轻微不平整,软骨细胞排列基本正常,基质染色略浅于sham组,潮线结构较清晰,半月板形态正常。ACLT组可见软骨浅层侵蚀和深达中层的裂缝,周围软骨细胞数量减少,损伤区基质染色变浅,潮线结构欠清晰,半月板碎裂。然而,ACLT+OVX组可见更为广泛的、深达软骨深层的侵蚀和裂缝,局部可见软骨下骨板塌陷,软骨细胞显著减少,基质染色变浅,潮线不清晰,半月板崩解、移位。ACLT组的OARSI评分显著高于sham组（P<0.005）,但低于ACLT+OVX组（P<0.005）,OVX组和sham组的评分无显著差异（P>0.05）。3.Micro-CT分析结果:ACLT组的Tb.Th显著低于sham组,而SMI高于sham组（P值均<0.05）,OVX组的BMD、BV/TV和Tb.Th显著低于sham组,而SMI显著高于sham组（P值均<0.05）。然而,与其他三组相比,ACLT+OVX组的BMD、BV/TV和Tb.N明显降低,SMI和Tb.Sp显著增高（P值均<0.05）,而Tb.Th显著低于sham组（P<0.001）。第二部分雷洛昔芬对前交叉韧带切断联合卵巢切除诱导的大鼠骨关节炎防治作用的研究目的:本研究探讨雷洛昔芬（Raloxifene,RAL）对卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合前交叉韧带切断术（Anterior cruciate ligament transection,ACLT）诱导的大鼠绝经后骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的防治效果。方法:1.12周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠共60只,随机分为5组:sham组,ACLT组、OVX组、ACLT+OVX组和RAL组（ACLT+OVX+RAL）,每组12只,又分为病理学观察和影像学分析两个亚组,每个亚组6只。2.ACLT组接受右膝ACLT手术,OVX组接受双侧OVX手术,ACLT+OVX组和RAL组同时接受ACLT和OVX手术,sham组接受假手术操作。RAL组大鼠从造模72h后开始每天予以RAL灌胃治疗,剂量为6.25mg/kg,每周测量体重并调整药量,其他组给予等体积的蒸馏水作为安慰剂治疗,疗程12周。3.12周后,收集各组的右膝关节标本,对影像学分析亚组标本的胫骨软骨面进行宏观评分,然后于75%乙醇中固定,并应用微型CT（Micro-computed tomography,micro-CT）检测软骨下骨。病理学观察亚组标本经固定、脱钙、包埋和切片后以甲苯胺蓝染色液染色,应用国际骨关节炎研究协会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）评分法评价软骨损伤情况。采用免疫组织化学法测定软骨中的II型胶原（Type II collagen,Col-II）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan,AGG）的积分光密度值（Integratal optical density,IOD）以评价表达水平。结果:1.宏观评分结果:sham组的软骨面光滑完整,光泽度好,关节囊与软骨界限清楚。OVX组的关节面基本光滑,但光泽较sham组差。ACLT组的内侧胫骨平台软骨面后部可见深达中层的侵蚀,伴有软骨褪色,光泽度明显变差,周围软组织增生肥厚。而ACLT+OVX组的软骨损伤更为严重,软骨失去光泽,可见大面积侵蚀达深层软骨,可见边缘软骨增生和后部软骨有全层缺损区,周围关节囊明显增生肥厚。RAL组的关节软骨侵蚀程度和光泽度明显好于ACLT+OVX组。ACLT组和ACLT+OVX组的宏观评分都显著地高于sham组（P<0.005）,但ACLT+OVX组高于ACLT组（P<0.005）,而RAL组评分显著低于ACLT+OVX组（P<0.005）。OVX组和sham组的评分未见显著性差异（P>0.05）。2.甲苯胺蓝染色及OARSI评分结果:sham组软骨表面光滑,结构清晰,软骨细胞排列整齐,基质着色均匀,潮线结构清晰,半月板形态正常。OVX组软骨表面可观察到轻微褶皱,软骨细胞排列基本正常,基质着色略浅,潮线较清晰。ACLT组可见软骨侵蚀达中层,并可见接近深层的裂缝,损伤区软骨细胞减少,基质染色明显变浅,潮线不清晰,半月板可见断裂。ACLT+OVX组可见软骨全层磨损,软骨下骨外露,其表层可见小缺损区域,内有纤维组织填充,半月板毁损。RAL组软骨侵蚀明显轻于ACLT+OVX组,潮线较清晰,而软骨下骨形态以及半月板损伤程度也明显好于ACLT+OVX组。ACLT组的OARSI评分均显著高于sham组（P<0.005）而明显低于ACLT+OVX组（P<0.005）,RAL组评分显著低于ACLT+OVX组（P<0.001）。OVX组和sham组的OARSI评分无显著差异（P>0.05）。3.免疫组化结果:ACLT组Col-II（P<0.005）和AGG（P<0.05）表达水平显著低于sham组,而ACLT+OVX组的Col-II（P<0.05）和AGG（P<0.05）表达水平显著低于ACLT组。RAL组Col-II（P<0.001）和AGG（P<0.05）水平显著高于ACLT+OVX组。OVX组的Col-II和AGG表达水平较sham组有降低趋势,但未见显著性差异（P>0.05）。4.Micro-CT分析结果:ACLT组的Tb.Th（P<0.05）显著低于sham组而SMI（P<0.005）明显高于sham组。与sham组相比,OVX组的BMD（P<0.01）、BV/TV（P<0.005）和Tb.Th（P<0.05）显著降低,而SMI（P<0.001）显著升高。然而,与ACLT组、OVX组和sham组相比较,ACLT+OVX组的BMD,BV/TV,Tb.Th和Tb.N均显著降低,而SMI和Tb.Sp显著增高（P值均<0.05）。RAL组的BMD（P<0.01）、BV/TV（P<0.001）和Tb.N（P<0.05）显著高于ACLT+OVX组,而SMI（P<0.001）和Tb.Sp（P<0.05）低于ACLT+OVX组。第三部分雷洛昔芬治疗前交叉韧带切断联合卵巢切除诱导的大鼠骨关节炎的作用机制研究目的:本研究对雷洛昔芬（Raloxifene,RAL）治疗卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合前交叉韧带切断术（Anterior cruciate ligament transection,ACLT）诱导的大鼠骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的效应机制进行探讨,为临床应用RAL治疗绝经后OA提供理论支持。方法:1.12周龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只,随机分为5组:sham组,ACLT组、OVX组、ACLT+OVX组和RAL组（ACLT+OVX+RAL）,每组6只。2.ACLT组的右膝予以ACLT手术,OVX组予以双侧OVX手术,ACLT+OVX组和RAL组同时予以ACLT和OVX手术,而sham组予以假手术操作。造模72h后,RAL组每天接受剂量为6.25mg/kg的RAL灌胃治疗,每周根据体重调整给药量,其他组以等体积的蒸馏水作为安慰剂,治疗12周后取材。3.收集所有大鼠的右膝关节,经过固定、脱钙、包埋和切片处理后,采用免疫组织化学染色分析软骨中X型胶原（Type X collagen,Col-X）、含凝血酶敏感素基序的整合素和金属蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5）、基质金属蛋白酶13（Matrix metalloproteinase-13,MMP-13）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3）、转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）和软骨下骨中I型胶原（Type I collagen,Col-I）的积分光密度值（Integratal optical density,IOD）以评价表达水平。此外,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色法对软骨下骨区域的破骨细胞数量进行分析。结果:1.免疫组化结果:ACLT组MMP-13、ADAMTS-5、COL-X、caspase-3和TGF-β1的表达水平均显著高于sham组（P值均<0.05）,但明显低于ACLT+OVX组（P值均<0.05）。而RAL组的上述因子表达水平均显著低于ACLT+OVX组（P值均<0.05）。OVX组的MMP-13和TGF-β1表达水平高于sham组（P值均<0.05）但低于ACLT+OVX组（P值均<0.05）,其他因子水平较sham组有升高趋势,但无统计学差异（P值均>0.05）。此外,OVX组的Col-I表达水平显著低于sham组（P<0.001）,但高于ACLT+OVX组（P<0.001）,而RAL组的Col-I表达水平显著高于ACLT+OVX组（P<0.001）。ACLT组的Col-I表达水平与sham组未见显著性差异（P>0.05）。2.TRAP染色结果:ACLT组和sham组软骨下骨的破骨细胞数量无差异（P>0.05）。OVX组的破骨细胞数量高于sham组（P<0.05）,但是低于ACLT+OVX组（P<0.001）。而与ACLT+OVX组相比,RAL组的破骨细胞数量显著减少（P<0.001）。结论:1.大鼠ACLT+OVX模型表现出极为严重的软骨退变、软骨下骨骨吸收和微结构损伤,具有类似人类绝经后骨质疏松性OA的病理变化特点,可做为绝经后OA相关研究的模型。2.RAL的早期干预具有减轻软骨和软骨下骨损伤的双重保护作用,从而有效地延缓ACLT联合OVX诱导的大鼠OA病程进展,提示RAL具有防治绝经后OA的临床应用潜力。3.RAL可能通过抑制TGF-β1和caspase-3的过度表达来延缓ACLT联合OVX诱导的大鼠OA软骨损伤,并通过抑制破骨细胞的活性来改善软骨下骨健康。