论文部分内容阅读
为了研究脊椎动物肥胖基因(Leptin gene)结构与功能关系,我们克隆了鳜鱼(Chineseperch)、鲢鱼(Silver carp)、鳙鱼(Bighead carp)、草鱼(Grass carp)和鲮鱼(Mud carp)Leptin基因cDNA核心序列,并通过RACE法克隆鳜鱼和鲢鱼Leptin基因cDNA全序列,并推测得到其相应氨基酸序列。从血液提取鳜鱼和鲢鱼基因组DNA并构建基因组文库,应用PCR克隆鳜鱼和鲢鱼Leptin基因的内含子序列,从而得到鳜鱼和鲢鱼Leptin基因组序列:鳜鱼Leptin基因序列全长1398 bp,由一个内含子和两个外显子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸,构成一个含有20个氨基酸信号肽的蛋白质,分子量为17.9 kDa;鲢鱼Leptin基因序列全长2194 bp,由两个内含子和三个外显子构成,其完整的开放阅读框由519 bp组成,起始密码子位于第二外显子中,编码172个氨基酸,构成一个含有20个氨基酸信号肽的蛋白质,分子量为19.6 kDa。应用Genome Walker方法克隆得到鳜鱼和鲢鱼Leptin基因的5′-侧翼区序列,并分析其结构功能,发现多个起转录调节作用的保守顺式调控元件。将我们克隆得到的硬骨鱼类Leptin氨基酸序列与其它物种相应的氨基酸序列分别进行同源性比较,并与已知同属I-型螺旋细胞因子家族的成员的脊椎动物CNTF和GH氨基酸序列一起构建系统进化树,发现不同物种间Leptin氨基酸序列差异非常大,但进化树分析显示所有的Leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,聚集成一簇;同时CNTF和GH序列也各自成簇,与Leptin进化分支共同聚集成一有根树,说明它们起源于共同的祖先基因。最后通过荧光实时定量PCR和Nothern杂交,研究鳜鱼和鲢鱼不同组织Leptin基因的表达水平:与哺乳动物Leptin基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼Leptin基因在所有被检测组织中均有表达:在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达;同时用Nothern杂交方法在鲢鱼肝脏中也检测到Leptin基因的转录物。本文对我国主要淡水养殖鱼类肥胖基因结构与组织特异性表达的研究将为进一步探讨鱼类肥胖基因对摄食、消化、代谢基因的调控作用及分子机制奠定良好基础。