DAB2IP蛋白(DOC-2/DAB2相互作用蛋白)是一个与卵巢癌,前列腺癌,乳腺癌和绒癌密切相关的肿瘤抑制蛋白,是通过酵母双杂交系统鉴定的有几个有效功能结构域,能与DOC-2/DAB2相互作用的蛋白。DAB2IP蛋白的主要特征是通过它的Ras GAP同源结构域影响Ras-介导的信号转导和生长抑制。另外,有研究报道DAB2IP蛋白的C2结构域能与凋亡信号调节激酶1(ASK1)结合,抑制ASK1与它的抑制剂14-3-3的结合,从而诱导细胞凋亡,因此这个蛋白也可以被称为ASK1相互作用蛋白(AIP1)。除此之外,还有越来越多的研究表明,DAB2IP蛋白在肿瘤细胞生长,转移和癌症进展等其他方面都发挥肿瘤抑制蛋白的作用。也有研究发现,由于表观遗传基因沉默导致异常的DAB2IP基因表达经常在癌症中被检测。例如在前列腺癌中,DAB2IP蛋白的表达能被它的启动子甲基化和组蛋白修饰抑制。而且我们前期也有数据表明,DAB2IP蛋白也能被E3泛素连接酶SCFFbw7以泛素蛋白酶体依赖的方式降解,从而抑制它对肿瘤细胞生长和转移的抑制作用。从目前对DAB2IP蛋白的大量研究分析,现在对DAB2IP蛋白调控的下游信号通路研究的比较多,也相对比较清楚,但是DAB2IP蛋白的上游调控机制依然不是很清楚。泛素介导的蛋白酶体降解是一个蛋白质选择性更新,能被大多数细胞过程利用的不可逆过程。而且已经有很多研究发现泛素蛋白酶体系统能通过介导多种肿瘤相关蛋白的降解调控肿瘤细胞的增殖和转移等生物学功能。泛素蛋白酶体系统是由三种酶的连续活化完成:分别是泛素活化酶(E1),泛素结合酶(E2s)和泛素连接酶(E3s),而且研究证实在泛素蛋白酶体系统中,E3泛素连接酶能控制底物特异性。例如E3泛素连接酶SPOP能通过泛素蛋白酶体系统降解ERG蛋白,从而抑制前列腺癌细胞的进展,还有E3泛素连接酶SCFβ-TRCP能通过泛素蛋白酶体系统降解肿瘤转移抑制基因-1(MTSS1)。因此,泛素蛋白酶体系统可能对许多肿瘤相关蛋白都有调控作用,这个提醒我们可以将泛素蛋白酶体系统作为肿瘤相关蛋白上游调控机制的一种进行分析研究。E3泛素连接酶Smurf1是HECT型E3泛素连接酶,是一个有致癌功能的Nedd4-样E3连接酶家族的一员,通常情况是通过它的WW结构域识别底物的PY序列与底物结合,并通过泛素蛋白酶体系统降解底物蛋白,但是目前也有研究发现Smurf1也能通过它的N-端C2结构域与Rho A结合并使其降解。由此表明Smurf1结合并降解底物蛋白除了通过经典的Smurf1 WW结构域识别底物的PY序列以外,Smurf1的其他结构域也可能参与其中。我们前期对Smurf1和DAB2IP蛋白的结构和功能都进行了仔细分析,发现虽然DAB2IP蛋白并不存在Smurf1识别的经典序列,PY序列,但是它们有共同的C2膜定位结构域,而且也有研究表明Smurf1识别底物蛋白并非必需依赖底物蛋白的PY序列,更重要的是,目前研究发现这两个蛋白在肿瘤细胞中发挥相反的作用,由此提示DAB2IP蛋白可能会被Smurf1通过非经典的方式结合并降解。基于我们对Smurf1和DAB2IP蛋白结构和功能的分析,我们设计了本实验。首先通过检测DAB2IP蛋白与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员之间的结合,确定结合DAB2IP蛋白的特异性E3泛素连接酶,通过抑制或过表达特异性E3泛素连接酶观察特异性E3泛素连接酶对DAB2IP蛋白表达水平的调控,验证了Smurf1是否介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。其次,检测已知的Akt介导的DAB2IP蛋白磷酸化是否影响Smurf1对DAB2IP蛋白的调控,分析Smurf1是否有Akt磷酸化位点并检测Akt介导的Smurf1磷酸化是否通过调节Smurf1蛋白自身稳定性进一步调控DAB2IP蛋白的表达水平,确定了Akt介导的这两个蛋白磷酸化是否影响Smurf1调控DAB2IP蛋白表达水平的过程。最后,构建了Smurf1和DAB2IP蛋白单独敲除及二者共同敲除的稳定细胞系(DU145和MCF-7细胞),通过细胞增殖(克隆形成和软琼脂集落形成实验)和迁移实验(划痕实验),探讨了Smurf1通过调控DAB2IP蛋白对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。方法:(1)利用免疫印迹和免疫共沉淀的方法探讨DAB2IP蛋白与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员之间的结合。(2)利用瞬时转染的方法将目的sh RNA片段与慢病毒载体连接,包被病毒,感染目的细胞建立稳定的基因敲除细胞系,观察抑制Smurf1对DAB2IP蛋白表达水平的影响。(3)利用瞬时转染过表达Smurf1的细胞系或者稳定敲除Smurf1的细胞系,利用蛋白半衰期实验检测Smurf1对细胞内DAB2IP蛋白半衰期的影响。(4)利用体内泛素化分析实验检测Smurf1是否通过泛素化降解途径调控DAB2IP蛋白的降解。(5)瞬时转染Akt的活化形式,利用免疫印迹和免疫共沉淀的方法检测Akt对DAB2IP蛋白和Smurf1蛋白磷酸化水平的影响,并检测Akt介导的这两个蛋白磷酸化对Smurf1介导的DAB2IP蛋白表达水平的影响。(6)利用瞬时转染的方法将目的sh RNA片段与慢病毒载体连接,包被病毒,感染目的细胞建立稳定的基因敲除细胞系,利用划痕实验观察不同组细胞之间迁移速度的差异。(7)利用克隆形成实验,检测不同组肿瘤细胞克隆形成的变化。(8)利用软琼脂集落形成实验,观察不同组肿瘤细胞集落形成的改变。结果:(1)免疫印迹和免疫共沉淀结果显示,DAB2IP蛋白可以与Nedd4-样E3泛素连接酶家族成员中的Smurf1相结合。(2)利用sh RNA抑制内源性的Smurf1可以增加不同细胞系(DU145,MCF-7和T98G细胞)内DAB2IP蛋白的表达水平。同时蛋白降解实验也显示,过表达Smurf1能降低DAB2IP蛋白的表达水平。(3)蛋白半衰期实验结果显示,过表达Smurf1能明显缩短DAB2IP蛋白的半衰期,抑制Smurf1表达则能明显延长DAB2IP蛋白的半衰期。(4)体内泛素化实验证实,Smurf1能以泛素蛋白酶体系统依赖的方式降解DAB2IP蛋白。(5)一系列蛋白降解实验和免疫共沉淀实验显示,Akt介导的DAB2IP蛋白磷酸化并不影响Smurf1调控DAB2IP蛋白的表达水平,而Akt介导的Smurf1蛋白磷酸化能通过增加Smurf1自身的稳定性,从而促进Smurf1介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。(6)利用sh RNA分别抑制Smurf1和DAB2IP或两者共同抑制构建的不同细胞系(DU45和MCF-7细胞),通过划痕实验结果显示,与对照组比较,单独敲除Smurf1可以明显抑制细胞的迁移速度,两者共同敲除则能减弱Smurf1单独敲除时对细胞迁移速度的抑制。(7)克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,与对照组比较,单独敲除Smurf1可以明显抑制细胞的克隆形成和集落形成,两者共同敲除则能减弱Smurf1单独敲除时对细胞克隆形成和集落形成的抑制。结论:E3泛素连接酶Smurf1特异性结合DAB2IP蛋白并介导DAB2IP蛋白的泛素化降解。Akt通过介导Smurf1 E3泛素连接酶的磷酸化增加Smurf1蛋白的稳定性,从而调控Smurf1介导DAB2IP蛋白的泛素化降解过程。Akt介导的Smurf1磷酸化及稳定性增加能通过调控DAB2IP蛋白的表达水平控制肿瘤细胞的增殖与迁移。