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丹参(Salvia miltiorrhiza),唇形科鼠尾草属的一种常用药材,常以根和根茎入药。脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹酚酸类化合物是丹参中的两大类有效成分。目前,因其广阔的应用前景与野生资源的供不应求之间的矛盾使得丹参酮/丹酚酸的代谢工程研究成为一个热点。茉莉酸(JA)信号通路在拟南芥中已研究的颇为透彻,b HLH类转录因子MYC2是JA信号通路的关键转录因子,在黄酮类物质(如花青素)的合成过程中起着举足轻重的正调控作用。本实验首先从拟南芥中克隆获得At MYC2,通过植物遗传转化获得p CAMBIA2300+-At MYC2过表达的阳性毛状根株系,发现At MYC2不仅能提高丹参酮的含量,还能提高丹酚酸的含量(表现最好的转基因丹参毛状根株系At MYC2-3中总丹参酮含量达到16mg/g DW,比对照高出5.4倍;同时丹酚酸含量达到95mg/g DW,比对照组高出3.3倍)。同时测定了丹参酮/丹酚酸合成途径中关键酶基因的表达量,发现大部分关键酶基因表达量上调。以At MYC2的c DNA序列为电子探针,通过本地BLAST方法,克隆获得了丹参的MYC类转录因子Sm MYC2-like/Sm JAM3。分别构建植物过表达载体和RNAi/SRDX载体,利用农杆菌C58C1介导遗传转化丹参无菌苗获得丹参毛状根。并分析了其分子生物学特性,研究了Sm MYC2-like/Sm JAM3在丹参酮、丹酚酸及萜类代谢途径中的功能,这对深入认识丹参酮/丹酚酸的合成调控机理具有重要作用。同时还探究了这两个基因在JA信号通路中的作用,进一步完善了丹参茉莉酸信号传导通路。现阶段取得的成果如下:(1)分子生物学特征分析:发现同At MYC2一样,Sm MYC2-like/Sm JAM3含有b HLH结构域,JID结构域,NLS结构域,且分别同At MYC2、At JAM3亲缘关系极近,并在细胞核中定位。(2)组织表达谱分析:发现Sm MYC2-like在主根、须根、茎、老叶、嫩叶、叶柄组织中均有表达,但是表达差异明显。在茎中表达量最高,其次是嫩叶,在主根、须根、老叶中表达量较低。Sm JAM3在各个组织中均有表达,但差异不大。(3)诱导表达谱分析:发现和拟南芥At MYC2一样,Sm MYC2-like受MJ、YE、ABA、GA3、SA、ET等诱导子的诱导并且效果显著,说明Sm MYC2-like有可能参与到丹参的各种激素信号通路中。Sm JAM3不受MJ、YE、ABA的诱导,SA有较明显的诱导效果,GA3和ET有较弱的诱导效果。(4)转基因毛状根的获得:构建了植物过表达载体p CAMBIA2300+-Sm MYC2-like/Sm JAM3,p CAMBIA2300+-Sm MYC2-like-SRDX载体与p HB-Sm JAM3-RNAi载体,通过遗传转化共获得Sm MYC2-like过表达毛状根株系14个,SRDX株系16个;Sm JAM3过表达毛状根株系11个,RNAi株系13个。(5)关键酶基因表达谱分析:测定了上述株系丹参酮和丹酚酸合成途径中的关键酶基因表达水平。发现同At MYC2不同,Sm MYC2-like只对丹参酮合成途径中的CYP76AH1和GGPPS有调控作用,且上调GGPPS、下调CYP76AH1;只对丹酚酸合成途径中的RAS有上调作用。Sm JAM3对丹参酮合成途径中的关键酶没有影响,能下调丹酚酸合成途径中的RAS。(6)丹参酮和丹酚酸含量分析:发现Sm MYC2-like和Sm JAM3均能上调丹参酮的含量,却并不参与丹酚酸的合成调控。(7)酵母双杂实验:结果表明Sm MYC2-like/Sm JAM3蛋白分别能与Sm JAZ3/Sm JAZ9蛋白相互作用,说明这两个基因可能参与到JA信号通路的调控中。(8)模式植物拟南芥中的功能验证:本研究还在拟南芥中进行了Sm JAM3基因的异源表达,发现该基因可能通过负调控At MYC2/At MYC3/At MYC4,和正调控At JAM1来进一步调控MYC2下游靶基因At ERF1、At MYB75、At PDF1.2、At VSP2的表达。综上所述,本论文研究了拟南芥At MYC2在丹参中异源表达对丹参酮和丹酚酸合成途径的代谢调控作用,以此为基础,进一步挖掘并克隆了两个丹参内源MYCs转录因子的作用Sm MYC2-like/Sm JAM3,并深入研究了这两个基因的生物功能,为丹参酮/丹酚酸的代谢工程研究及丹参种质资源的改善提供了一定的理论基础。