玉米高蛋氨酸蛋白基因dzs18的克隆及原核表达载体的构建

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玉米籽粒中蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸含量非常少,存在氨基酸不平衡、营养价值低的问题。尤其是玉米作为主要的饲料原料之一,即便与大豆等其他作物混合制成的产品,蛋氨酸依然不足。玉米中,蛋氨酸含量的高低取决于高蛋氨酸蛋白质即δ-zein的有无及含量的高低,但其结构基因表达与调控机理还不清楚。  为探明玉米中高蛋氨酸蛋白基因的表达与调控机理,开发用于通过蛋白质免疫印迹鉴定和筛选高蛋氨酸蛋白的玉米种质所需的δ-zein特异性抗体,本研究根据Maize GDB和NCBI相关网站上发布的玉米高蛋氨酸蛋白基因dzs18基因的DNA序列及其他有关信息,采用电子克隆技术,从玉米自交系 Mo17基因组中克隆出了高蛋氨酸蛋白(18k Daδ-zein)的编码基因(即δ-zein家族的高蛋氨酸蛋白基因dzs18);从玉米自交系Mo17中克隆出的目的基因Mdzs18,目标DNA序列长度为729bp,含有完整有功能的开放阅读框(ORF)。与玉米标准基因组参考序列相比,目的基因 Mdzs18,在 DNA序列上存在一个碱基突变,该突变在开放阅读框(ORF)的内部,位于自起始密码子第一个碱基开始下游第325个碱基处,由A突变为G,导致该位置的遗传密码从AUA突变为GUA,造成由目的基因编码的蛋白质氨基酸序列中第109个氨基酸从异亮氨酸(I)变异为缬氨酸(V)。Mdzs18编码由211个氨基酸组成的蛋白质,其蛋白质氨基酸序列中,蛋氨酸残基数占氨基酸残基总数的23.7%;尤其是,在蛋白质氨基酸序列的中部,即第75个氨基酸到第167个氨基酸之间,都存在一个由93个氨基酸序列构成的蛋氨酸高密区,蛋氨酸残基数所占比率为45.2%;该蛋白质多肽链的N-末端含有1个由21个氨基酸构成的信号肽,剪切位置在第21个氨基酸(丙氨酸,A)和第22个氨基酸(苏氨酸,T)之间。本研究中,利用从Mo17中分离的目标 DNA成功构建出高蛋氨酸蛋白基因 Mdzs18的原核表达载体pGEX4T1-dzs18;目的基因Mdzs18正确插入到载体中的GST标签基因的下游,目的基因与 GST标签基因形成无移码突变的有功能连续的开放阅读框架;目的基因与GST标签基因构成有功能的GST-dzs18融合基因,该融合基因的连续阅读,产生GST-DZS18P融合蛋白。
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