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近年来研究表明,乳腺癌是一种干细胞疾病,其起源于体内少数具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群,该群细胞具有极强的致瘤能力,即乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BrCSCs)。BrCSCs在乳腺癌的发病、侵袭、转移、治疗抵抗和复发等方面起着关键作用。BrCSCs的发现从全新的视角认识乳腺癌这一疾病,为乳腺癌的防治提供了新的思路。由于BrCSCs在乳腺癌原发肿瘤中含量极低,所以细胞的获取已经成为BrCSCs相关研究的技术瓶颈。因此,如何分离获取BrCSCs,研究其生物学行为和可能的调控机制,对明确乳腺癌的发病机理、了解乳腺癌的诊断预后、制定乳腺癌的个体化治疗方案和最终根治乳腺癌等有着重要意义。据报道,接受化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织和循环血液中CD44+CD24-表型BrCSCs比例明显增加,利用化疗药物联合无血清悬浮培养可富集和纯化小鼠的BrCSCs。但是,不同周期化疗对BrCSCs分离培养的影响以及化疗后BrCSCs在乳腺癌组织中的存在方式(形态)并不清楚。因此,如何从新辅助化疗后的乳腺癌组织中获取BrCSCs值得探讨。我们在从乳腺癌组织中分离BrCSCs的过程中发现,新辅助化疗后的部分乳腺癌组织中可分离出的一种球体状细胞团,与文献报道中所培养的乳腺癌干细胞微球体(mammospheres,MSs)形态极其相似,因其来源于化疗后乳腺癌组织,为了表述方便和避免文中与MSs相混淆,故将其命名为乳腺癌化疗微球体(chemotherapy microspheres,CMSs)。本研究拟通过体外培养、诱导分化、细胞表型分析、干细胞相关标记物检测和动物致瘤实验等方法,对CMSs进行鉴定,并探讨了不同周期化疗对CMSs分离的影响以及CMSs、不同周期化疗与乳腺癌分子亚型之间的关系,以期为BrCSCs获取的新方法提供实验依据。第一部分乳腺癌化疗微球体的分离培养与细胞表型分析目的观察CMSs和MSs的形态差异;探讨乳腺癌化疗微球体细胞(chemotherapy microsphere-derived cells, CMSDCs)的自我更新和多向分化能力;分析CMSDCs及其分化细胞的表型差异。初步鉴定CMSDCs是否具有肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的特性。方法将CMSs接种于添加生长因子的无血清培养基中悬浮培养,观察CMSs在培养基中的球体形态和折光性的变化,比较CMSs与MSs之间的差异;应用连续无血清传代生成新的CMSs检测CMSDCs的自我更新能力,血清诱导CMSDCs分化检测其分化能力;采用免疫荧光标记法,激光共聚焦显微镜观察上皮特异性抗原(ESA)、巢蛋白(Nestin)在CMSDCs中的表达;检测细胞角蛋白CK14、细胞角蛋白CK18和细胞角蛋白CK19在CMSDCs及其分化细胞中的表达;流式细胞术检测CMSDCs中CD44+CD24-表型细胞的比例;ALDEFLUOR实验检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+表型细胞的比例。结果CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,与MSs形态相似,培养3 d后球体折光性增强,球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可连续传代形成新的CMSs,经血清诱导后细胞贴壁生长,由圆形变成梭形;CMSDCs呈ESA阳性表达,而不表达神经干细胞标记物Nestin,证实其为上皮细胞来源;CMSDCs表达乳腺干/祖细胞标记物CK19,而不表达分化标记物CK14和CK18,CMSDCs的分化细胞则表达CK14和CK18,而不表达CK19;3例标本中仅有1例标本的CMSDCs中含有CD44+CD24-表型细胞;3例标本的CMSDCs中均含有ALDH1+表型细胞,诱导分化后该表型细胞比例大幅度下降。结论CMSDCs在体外具有自我更新和多向分化潜能,含有较高比例的ALDH1+表型细胞。CMSs可能是化疗压力下扩增形成的富含BrCSCs的细胞微球体。第二部分乳腺癌化疗微球体细胞耐药性及其Oct-4和ABCG2的表达目的检测CMSDCs及其分化细胞的耐药性,干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药蛋白ABCG2在CMSDCs及其分化细胞中的表达,进一步对CMSDCs进行鉴定。方法MTT法检测多西他赛和表柔比星对CMSDCs及其分化细胞的抑制率;采用RT-PCR技术检测CMSDCs及其分化细胞中Oct-4基因的表达;应用Western blot检测CMSDCs及其分化细胞中ABCG2蛋白的表达结果CMSDCs对多西他赛和表柔比星耐药,而其分化细胞对上述药物敏感;CMSDCs高表达Oct-4和ABCG2,分化后上述标记物表达降低或缺失。结论CMSDCs对化疗药物耐药,表达干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药标记物ABCG2,符合肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的特征。第三部分乳腺癌化疗微球体细胞的动物致瘤实验目的检测CMSDCs及其分化细胞的动物致瘤性,探讨小鼠成瘤细胞的生物学特性,进一步对CMSDCs进行鉴定。方法构建NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫移植肿瘤模型,观察CMSDCs的成瘤情况;检测小鼠肿瘤细胞中ALDH1~+表型细胞的比例;观察小鼠肿瘤细胞在无血清培养基中的克隆球形成能力,球体细胞在含血清培养基中的分化情况。结果1×10~3个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫内重建肿瘤,而相同数量的分化细胞不能在小鼠体内成瘤;小鼠肿瘤细胞内含有少量的ALDH1~+表型细胞;小鼠肿瘤细胞在体外无血清培养基中可形成MSs,并能连续传代,MSDCs血清诱导可贴壁生长。结论CMSDCs具有极强的致瘤性,小鼠肿瘤细胞与亲代细胞特性相似。CMSDCs符合干细胞的特征,可用于乳腺癌干/祖细胞的研究。第四部分不同周期化疗对乳腺癌化疗微球体形成的影响目的探讨不同化疗周期对CMSs形成的影响,为从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs提供实验依据。方法从化疗后的乳腺癌组织中分离细胞,在无血清培养基中悬浮培养,观察有无CMSs形成;通过无血清培养并绘制生长曲线,评估不同化疗周期标本CMSDCs的增殖能力;通过克隆形成实验,计算CMSs形成率(mammosphere forming efficiency, MSFE),评估不同化疗周期标本的CMSDCs的自我更新能力;血清诱导CMSDCs分化,测绘生长曲线,评估不同化疗周期标本CMSDCs的分化能力;流式细胞术检测不同化疗周期标本CMSDCs中ALDH1~+表型细胞比例。结果化疗1个周期的7例乳腺癌标本经培养均无CMSs形成,化疗2个周期的6例标本经培养其中3例有CMSs形成,化疗3个周期以上的16例标本中11例可以直接分离出CMSs,其余4例仅得到少量坏死的细胞和组织碎片;CMSDCs在含血清的培养基中贴壁分化。化疗3个周期以上的CMSDCs相对于化疗2个周期的CMSDCs传代次数多,增殖速度快,贴壁能力强,含有更高比例的ALDH1~+表型细胞。CMSs多见于基底样乳腺癌和Her2过表达型乳腺癌。结论从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs宜选取化疗3个周期及以上的标本;新辅助化疗促进了BrCSCs的自我更新和分化能力;ALDH1+表型的BrCSCs比CD44+CD24-表型的BrCSCs在乳腺癌中分布更加广泛;CMSs的产生与乳腺癌的某些分子亚型有关。