多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase, PG)是一类细胞壁水解酶。在植株生长发育的细胞分离事件中,它通过降解果胶发挥重要作用。PG基因家族众多成员间在基因结构和表达方式上存在变异和分化,并且许多成员间可能存在功能冗余。在全基因组重复和串联重复等重复事件发生的过程中,产生了许多重复PG基因。伴随着基因组片段的碎片化和重排,造成了PG基因的分化和丢失。前人已经对若干物种的PG基因家族成员的进化和分类进行了一定程度的探讨。但是在PG基因家族扩张的模式和程度、作用于PG基因家族扩张的机制,重复PG基因的表达特征和差异、PG基因家族成员的丢失和保留机制、种间存在共线性的PG基因的功能鉴定等方面尚不甚明了。在种子植物的有性生殖过程中,花粉与授粉受精和后代繁衍有关。花粉内壁和花粉管壁的主要成分均为果胶,PG与花粉发育和花粉管形成密切相关。单个PG基因在花粉发育和花粉管形成过程中可能的功能已经在许多物种中被鉴定,但是对于重复PG基因在这一过程中的表达差异和功能分化的研究还鲜有报道。我们以芸薹属物种甘蓝和白菜为实验材料,结合已经公布的全基因组测序数据和本课题组前期获得的白菜PG基因的序列和表达数据,对甘蓝PG基因家族成员的表达和进化进行了深入研究,并对白菜和甘蓝PG基因家族成员扩张的模式和程度、进化过程中的保留和丢失情况、重复PG基因的表达特征和差异,以及在两个物种存在共线性的PG基因在三个亚基因组上的分布进行了比较。针对在种间存在共线性的PG基因发生丢失和重复PG基因间存在表达差异等问题,我们对在白菜中的共线性基因发生丢失的甘蓝PG基因BoMF25(基因ID:Bol018697)以及白菜重复基因BcMF26a(基因ID:Bra011440)和BcMF26b(基因ID:Bra037005)进行了深入研究。获得的主要结果和结论如下：(1)在甘蓝中鉴定到了102个PG基因。利用氨基酸全序列构建进化树,依据氨基酸序列的相似性,甘蓝PG被划分为A-H八个亚类。分析不同亚类成员拷贝数目的变化,发现进化过程中,A-F亚类的成员存在较高比例的获得和丢失。通过qRT-PCR分析,发现A和E亚类的成员几乎在根、茎、叶片、花序和嫩角果组织中都有表达；B亚类成员除了叶片中没有表达外,在其他器官中均有表达：C、D和F亚类成员则主要在生殖器官花序和角果中表达。共同祖先基因的推测结果表明,白菜和拟南芥PG成员至少存在76个推测的共同祖先基因,甘蓝与拟南芥则至少存在82个。在与拟南芥分离之后,白菜PG基因家族相较于甘蓝发生了更加快速的扩张。对PG基因保留率进行分析,发现在全基因组三倍化后,白菜PG基因家族成员的保留率高于甘蓝。比较重复PG基因的时空表达特征,结果表明,重复PG基因间的表达差异存在4种主要表现形式：表达方式相同或是均不表达,表达部位部分重叠但又存在分化,一个基因不表达而另一个基因选择性地在植株某些器官中表达,以及在不同器官中表达。通过比较在白菜和甘蓝三个亚基因组上共线性PG基因的分布,发现其分布情况基本一致,但也存在其中一个物种中的共线性基因发生丢失的现象。(2)同源比对结果表明,Brassica oleracea Male Fertility 25(BoMF25)为拟南芥PG基因At4g35670的同源基因。通过拟南芥、甘蓝与白菜基因组间的共线性分析,发现BoMF25在白菜中的共线性基因是由于基因重复过程中其所在染色体区块发生了碎片化和重排而丢失。通过qRT-PCR分析,结果表明,BoMF25主要在花粉发育晚期的花药中表达。通过启动子顺式调控元件和保守基序预测,发现其推测的启动子序列含有经典的顺式调控元件和花粉特异的基序。利用启动子活性分析,发现其可以驱动GUS基因在花粉发育晚期花药中的表达。通过原位杂交分析结果表明,表达信号特异出现在成熟花粉粒中。亚细胞定位实验结果表明,BoMF25可以被定位到细胞壁上,说明其可能是作用于花粉壁上的分泌蛋白。(3)同源比对结果表明,Brass ica campestris Male Fertility 26a (BcMF26a)和BcMF2 6b是拟南芥PG基因At4g33440的同源基因。通过共线性分析发现,BcMF26a 和 BcMF26b是由进化过程中染色体区段化的重复产生的。qRT-PCR分析结果表明,在白菜不同组织器官中,BcMF26b的表达水平远远高于BcMF26a。通过启动子活性分析,发现在生殖生长期,BcMF26b启动子驱动GUS基因在绒毡层、花粉粒和雌蕊发育晚期表达,而BcMF26a启动子驱动GUS活性只在花蕾发育早期的雌蕊中表达。它们在进化过程中可能发生了新功能化和亚功能化。通过序列相似性比对,发现它们的调控序列之间和内含子序列之间的相似性均较低,说明可能是调控序列间和内含子序列间的差异导致了其表达差异。分析At4g33440的T-DNA插入突变体的表型,发现At4g33440的缺失表达延缓了花粉管的生长速度。利用amiRNA技术共同抑制BcMF26a和BcMF26b的表达,发现表达受抑制的转基因植株的花粉内壁发育异常,花粉管不能正常生长。亚细胞定位实验结果表明,BcMF26a和BcMF26b定位在细胞壁上。结合BcMF26a在不同组织器官中的表达水平远远低于BcMF26b,以及启动子活性分析实验中BcMF26b启动子可以驱动GUS信号在花药、绒毡层和三核成熟花粉粒中表达的实验结果,我们认为,在bcmf26a/bcmf26b转基因植株中,主要是BcMF26b的降低表达引起花粉内壁发育异常,进而导致花粉败育和花粉管不能正常形成。