研究背景不孕不育是社会广泛关注的公共卫生问题,大约影响了全世界8-12%的育龄夫妇,并且有40-50%可能是由于“男性因素”造成的不育,其中精子数量和质量降低是男性不育最主要的原因。研究表明,许多环境内分泌干扰物(EEDs)都能造成人和动物的生殖系统损伤,并降低男(雄)性的精子质量。三氯生(TCS)是一种广泛用于个人洗护用品和临床消毒的酚类广谱抗菌剂,被认为是潜在的EEDs。精子的产生是一个高度有序的过程,依赖于睾丸生殖细胞增殖、分化和死亡之间的平衡调节,自噬是不同于凋亡的一种细胞死亡形式,适度的自噬能促进精子的分化和成熟,保护生精细胞免受有害条件的侵害,超过细胞承受能力的自噬将诱导细胞Ⅱ型程序性死亡。本课题组选取10对精液质量异常的病例组和正常对照组的精液样本,通过自噬功能基因芯片和相关文献报道,筛选出可能与TCS相关并导致精液质量降低的CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四个自噬基因,目前,TCS是否通过细胞自噬导致生殖损伤尚未见报道,本文旨在探讨TCS暴露通过自噬基因的调控作用导致生殖损伤的可能机制。材料与方法第一部分:自噬基因的筛选及人群验证。研究对象选自2016年6月至2017年9月期间在深圳市某三甲医院生殖中心进行精液检查的男性,收集其精液样本、精液常规结果和问卷信息。方法:1.选取精液质量异常和和精液质量正常的受试对象各10例,进行精液自噬基因芯片检测,并结合文献报道与EEDs作用机制相关的基因,筛选出可能与TCS相关并导致精液质量降低的自噬基因。2.采用成组设计的病例对照的研究方法,选取精液质量异常的病例104例,精液质量正常的对照250例,采用Trizol法提取精液总RNA,逆转录成cDNA,qPCR的对上述差异表达基因进行验证。第二部分:TCS经口暴露的动物实验。用TCS对8周龄的SD大鼠进行经口暴露染毒,以未观察到有害作用水平(NOAEL=50mg/kg/d)为中等暴露剂量,设计暴露剂量梯队。在空白组、玉米油溶剂对照组(1Omg/kg)、低剂量组(10mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)和高剂量组(250mg/kg)五个实验组中,观察睾丸组织损伤和相关自噬基因的表达。方法:3.用HE染色,透射电镜方法观察睾丸组织的病理损伤。4.用免疫组织化学、qPCR和蛋白印迹技术对筛选的自噬相关基因进行检测。结果1.自噬基因芯片筛选中,与对照组相比,在84个自噬相关功能基因中,有18个自噬基因表达差异倍数大于2且全部表达下调,结合文献报道,最终筛选出CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四个可能与TCS相关并导致精液质量降低的自噬基因。2.在人群验证中,相对于对照组,ESR1基因在病例组表达显著下降(P<0.05),CXCR4、PTEN和LC3B在病例组均有下降趋势,但无统计学意义。3.TCS暴露组中,HE染色结果显示:睾丸曲细精管发生损伤,出现空泡样改变,精子减少,各剂量组具有剂量-反应关系。透射电镜同样发现了 HE染色显示的组织损伤,同时发现成熟的自噬溶酶体结构、线粒体和高尔基体出现肿胀和空泡。4.免疫组化结果显示,LC3B在空白组和溶剂对照组中,只有少量浅黄色颗粒,而在低、中和高剂量组中呈现大量棕黄色颗粒,并随着剂量增加远离曲细精管管腔分布。CXCR4,ESR1和PTEN在各组间没有差异;与对照组相比,qPCR结果显示LC3B基因表达在病例组中表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05);蛋白印迹结果显示,LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值在低剂量组和中剂量组表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1.自噬相关基因ESR1在人群精液中的低表达,可能与精液质量降低有关。2.TCS暴露导致大鼠睾丸曲细精管损伤,生精细胞脱落和减少,表明TCS具有一定的生殖毒性。3.TCS暴露使雄性大鼠睾丸组织LC3B基因mRNA水平、LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值升高,提示自噬可能参与了TCS致大鼠睾丸组织损伤的过程。