背景1962年,Beer等从长春花中提取并分离得到了长春碱(vinblastine. VLB)和长春新碱(vincristine, VCR),经过不断探索研究,人们已从长春花中分离得到70多种生物碱,临床常用的该类药物有长春碱(VLB)、长春新碱(VCR)以及半合成的长春瑞滨(vinorebine,VRB)和长春地辛(vindesine,VDS)。通过研究发现,长春新碱在该类药物中抗肿瘤活性最强,具有很强的微管蛋白结合能力,同时还能抑制RNA多聚酶活性并干扰蛋白质合成,能够很好抑制肿瘤细胞增殖。主要用于治疗何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病,也用于胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、软组织肉瘤、支气管肺癌及神经母细胞瘤等恶性肿瘤,此外长春新碱也用于治疗血小板减少性紫癜。长春新碱有很强的细胞毒作用,缺乏选择性,在临床应用中所导致的消化系统、免疫系统、神经系统等药物不良反应(ADR)事件也较为常见,所以临床常常采用联合用药的方式来降低长春新碱的使用剂量,这是限制其发挥效应的重要因素。脂质体(liposome)是以磷脂为主要材料,组成的囊泡状结构,与细胞膜相似,具有磷脂双分子层,通过该结构能够实现脂溶性和水溶性药物包载,借助这一载体能够实现药物靶向递送,降低潜在毒性,提升药物稳定性。长循环热敏脂质体(Long circulation thermosensitive liposome,LTSL)在普通脂质体的基础上常使用PEG进行修饰(如常用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000,DSPE-PEG2000),增大空间位阻,降低了脂质体与血浆蛋白的结合,避免网状内皮系统(RES)的捕捉和吞噬,延长了脂质体在体内的循环时间,同时PEG的引入也能够防止脂质体自身的聚集,提高制剂的稳定性。其中,温度敏感性磷脂的应用,使脂质体能够在特定的相变温度(Tm)将药物释放到加热部位。当达到该温度时,脂质体的磷脂膜由原来紧密的全反式构象(胶晶态)转变为疏松的歪扭构象(液晶态),膜的流动性也随之大大提高,药物更容易被释放出来。通过使用不同的磷脂并调整所占比例能够制备得到不同相变温度的热敏脂质体。研究表明,将少量溶血磷脂(MSPC)引入热敏脂质体能够进一步提高其对温度的敏感性,加速在相变温度下的状态变化,提升释药速度。目的制备长春新碱长循环热敏脂质体,借助肿瘤EPR效应提高药物的靶向性,降低常见毒性反应,实现加热后药物的快速释放,提高治疗部位药物浓度。与市售注射用硫酸长春新碱比较,研究其细胞毒性及体内抗肿瘤活性,评价长春新碱热敏脂质体作为实体肿瘤治疗的预期效果及可行性。内容采用薄膜分散法制备空白脂质体,加压过膜控制粒径,pH梯度法主动载药,制备得到长春新碱长循环热敏脂质体(VCR-TSL,VTSL).以外观、粒径、含量、包封率、热敏特性、稳定性等为主要评价指标,筛选最优的处方工艺。使用高效液相色谱法建立长春新碱的含量及有关物质分析方法,采用超滤离心法测定脂质体包封率。利用透射电子显微镜测量并观察脂质体形态,采用激光粒度分析仪测定脂质体的粒径。利用稳定性分析仪追踪长春新碱长循环热敏脂质体5个月以上的稳定性,同时测定含量、包封率、粒径等变化。通过MTT法测定体外细胞毒性,激光共聚焦显微镜观察荧光标记(Cou-6)脂质体与细胞的相互作用。进一步建立裸鼠异种移植肿瘤模型,结合体外肿瘤部位加热,对长春新碱长循环热敏脂质体的药效学及毒性进行初步评价。结果采用DPPC、DSPE-PEG2000、MSPC为磷脂膜材料。通过对水化液,粒径控制工艺,冷冻保护剂用量和投料方法等进行系统筛选优化,确定了以薄膜分散法制备空白脂质体,以0.2M、pH3.0的酒石酸缓冲液为水化液,加压过膜法控制粒径以及pH梯度法主动载药的制备工艺。经过处方优化,制备得到的脂质体平均粒径在90nm左右：在透射电镜下观察,可见脂质体的外观圆整,粒径大小分布均匀。该工艺制备得到的脂质体药物包封率能够达到98%以上；多批样品制备处方工艺重现性良好。长期试验表明,脂质体在-20℃条件下放置5个月稳定性良好。体外细胞毒性评价说明长春新碱长循环热敏脂质体结合加热可显著增强细胞毒作用,在给药后72h脂质体组中,sw620细胞活性均小于5%,PANC细胞活性均小于20%。细胞摄取实验发现热敏脂质体加热后更易进入肿瘤细胞。体内实验结果表明,热敏脂质体结合肿瘤局部加热,具有良好的肿瘤增值抑制效果,抑瘤率达到了70%以上,同时,高剂量脂质体组裸鼠体重和注射液组无显著性差异,脂质体组裸鼠进食情况和活动能力较注射液组优,可以初步推断能够降低裸鼠全身毒性。结论本研究制备得到的硫酸长春新碱热敏脂质体具有良好的物理化学性质,工艺稳定重现性好,具有良好的热敏释药特性。体外细胞毒性实验中,肿瘤细胞抑制作用显著优于普通注射液；体内药效学研究显示其在实体瘤中的抑瘤活性明显高于普通注射液,有望增加适应症范围并开发成新的抗肿瘤药物。