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研究背景轴突脱髓鞘改变是脊髓损伤的重要病理变化,前期研究表明,移植少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)能够促进损伤轴突再髓鞘化。但是再生髓鞘的形态和厚度跟生理状态下髓鞘的产生存在差别,并且再髓鞘化的确切机制也不清楚。少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)中的PI3K/AKT和ERK通路激活后可以增强髓鞘形成相关蛋白的表达,其中髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)和蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)是髓鞘形成的主要蛋白。脊髓损伤后细胞间质内CXCL12升高,并与CXCR4特异性结合,跟OPCs的迁移和分化关系密切;而PI3K/AKT和ERK通路是CXCL12/CXCR4分子信号常见的下游通路。因此我们推测:在OPCs参与再髓鞘化的过程中,CXCL12是激活PI3K/AKT和ERK通路的关键因子,通过PI3K/AKT和ERK通路介导OPCs中MBP与PLP的高表达,对再生髓鞘形态及厚薄发挥重要的调控作用。拟采用免疫细胞化学技术、增强及阻断干预、体外实验等手段,阐明CXCL12/CXCR4在介导OPCs参与轴突再髓鞘化的作用机制。方法:1.用改良后的振荡分离和差速贴壁方法原代培养新生SD大鼠大脑皮质层OPCs,根据OPCs和OL细胞表面的特异性抗原表达的不同,利用免疫荧光实验技术进行分离鉴定;2.体外条件下检测浓度效应相关性,用Western blot方法检测不同浓度的CXCL12(0ng/m L、5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L)对髓鞘形成相关蛋白MBP和PLP蛋白表达的影响,并用免疫荧光方法检测MBP和PLP的表达变化;3.体外条件下检测时间效应相关性,用Western blot方法检测CXCL12(20ng/m L)在不同时间点(12h、24h、48h、72h)对髓鞘形成相关蛋白MBP和PLP表达的影响,并用免疫荧光方法检测MBP和PLP的表达变化;4.通过前期本实验室筛选出的CXCR4基因有效干扰靶点信息,用CXCR4si RNA干扰OPCs细胞膜上CXCR4蛋白表达,用Western blot方法检测CXCL12(20ng/m L)对少突胶质前体细胞CXCR4、MBP和PLP表达的影响,并用免疫荧光方法检测MBP和PLP的表达变化;5.用LY294002抑制PI3K/AKT通路活性,用U0126抑制ERK通路活性,用Western blot方法检测在CXCL12(20ng/m L)条件下,PI3K/AKT和ERK通路对髓鞘形成相关蛋白MBP和PLP表达中的影响,并用免疫荧光方法检测MBP和PLP的表达变化。结果:1.通过改良后的震荡分离和差速贴壁的方法进行OPCs原代培养,可以获得大量纯度高的OPCs。胞体近似圆形,周围可见对称双极或三极细胞突起,胞体小,直径约10μm,折光性好,PDGFR-α表达呈阳性;诱导中期OPCs胞体呈圆形,胞体周围纤细突起增多,O4表达呈阳性;诱导晚期胞体周围出现大量网状纤细突起,呈“分枝”状分布,MBP表达呈阳性。2.CXCL12的浓度跟MBP和PLP的表达呈浓度效应相关性。在一定浓度范围内,增加细胞外CXCL12的浓度,MBP和PLP的表达量逐渐增加。与0 ng/m L相比,CXCL12浓度为20ng/ml时,MBP表达量明显增加(p<0.01),PLP的表达量也明显增加(p<0.01)。免疫荧光实验结果显示:OPCs在不同浓度的CXCL12作用下处理48h后,在CXCL12浓度为20ng/m L时,MBP和PLP表达增加明显。3.CXCL12的作用时间跟MBP和PLP的表达呈时间效应相关性。在一定时间范围内,细胞外CXCL12浓度为20ng/m L并增加作用的时间,MBP和PLP的表达量逐渐增加。与0h相比,作用时间为72h时,MBP表达量明显增加(p<0.01),PLP的表达量也明显增加(p<0.01)。免疫荧光实验结果显示:CXCL12浓度为20ng/m并作用时间为72h时,MBP和PLP均能观察到明显的表达。4.CXCR4si RNA干扰CXCR4蛋白表达后,与对照组相比,OPCs髓鞘形成相关蛋白MBP和PLP的表达量明显受到抑制(P<0.01)。免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,CXCR4si RNA干扰组的MBP和PLP蛋白表达量明显降低。5.与CXCL12组相比,CXCL12+LY294002组的p-AKT蛋白表达量明显降低(t=-19.630,P<0.01),CXCL12+U0126组的p-ERK蛋白表达量也明显降低(t=-6.005,P<0.05),并且CXCL12+LY294002和CXCL12+U0126组的MBP和PLP蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。免疫荧光实验结果显示:与CXCL12组相比,CXCL12+LY294002组和CXCL12+U0126组MBP和PLP蛋白相对表达量明显降低。结论:1.本实验体外培养OPCs,通过改良后的震荡分离和差速贴壁的方法进行OPCs原代培养,能够获得纯度较高的OPCs。2.增加细胞外CXCL12的浓度以及作用时间,髓鞘形成相关蛋白MBP和PLP的表达量逐渐增加。3.干扰CXCR4蛋白表达以及抑制AKT、ERK通路活性,MBP和PLP蛋白相对表达量明显降低。