论文部分内容阅读
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种具有神经嗜性的α型疱疹病毒，可感染猪、牛、羊等多种家畜及野生动物。疫苗免疫只能阻止动物发病和临床症状的产生，但不能阻止病毒在宿主体内建立潜伏感染。如果淘汰全部PRV潜伏感染猪，需要付出巨大的经济和社会代价，不符合我国当前的国情。所以伪狂犬病毒的潜伏感染已成为预防和根除伪狂犬病的重大障碍。本试验以PRV在猪体内建立潜伏感染为基础，从DNA、RNA等不同层次水平上检测了IE180、EP0、LAT等PRV潜伏感染相关基因在潜伏感染的建立、维持和激活过程中的时空表达情况，确定影响PRV潜伏感染的关键基因，为剖析PRV潜伏感染的机理和伪狂犬病的根除计划提供实验数据和理论依据。本试验购买30日龄PRV阴性健康仔猪，进行首免和加强免疫，用ELISA和中和试验检测仔猪血清抗体水平，当血清抗体水平达到1：2或1：2以上时，我们分别通过滴鼻和颈部肌肉注射各2 mL病毒液(PRV gG-／LacZ+，TCID50=10-6.5／0.1mL)对仔猪进行攻毒。攻毒后1周内每天上午和下午分别采集攻毒猪的鼻拭子和测量体温，通过PCR方法检测PRV的糖蛋白gD基因，发现攻毒4天后猪不再向外界排毒；体温测量结果表明，攻毒后猪只体温迅速升高，在2天左右达到峰值，而后慢慢降低；每隔一周，我们剖杀试验感染猪，采集血清和三叉神经节、脑、嗅球等神经组织及心肌、肺、肝脏、脾脏等脏器，于-80℃冷冻保存。攻毒45天后，我们按2mg／kg体重的剂量通过颈部肌肉注射地塞米松，连续注射5天，以激活PRV的潜伏感染。病毒激活后我们依然每天采集鼻拭子和测量体温，其结果与攻毒后排毒情况和体温变化结果基本一致。在实验室条件下，我们提取冻存组织的DNA，通过gD-PCR方法检测病毒在猪体内的组织分布。验证了神经组织，尤其是三叉神经节是病毒建立潜伏感染的最主要位置。本实验中，检出率最高的器官为三叉神经节和脑干，均为100％，其次为嗅球、大脑，小脑等神经组织，此外淋巴结和脾脏等淋巴器官的检出率也较高，心、肝、肾等脏器的检出率较低。我们知道，PRV基因组的转录是级联式的，即立即早期基因、早期基因和晚期基因是按照时间的先后顺序依次表达，后一期基因的表达依赖于上一期基因的表达。我们选取IE180、EP0和LAT等PRV潜伏感染相关基因作为研究对象，在RNA水平上检测了各基因的时空表达表达情况。检测结果发现，在潜伏感染过程中，除了LAT的大量存在和表达外，IE180基因的表达也是持续存在的；而EP0基因一旦在激活中晚期基因的表达后就立即停止自身的表达；晚期糖蛋白基因gD的表达依赖于IE180基因和EP0基因的共同作用。