研究背景胃癌是一种恶性肿瘤,主要发生于胃黏膜上皮。胃癌发病率居于世界第四位,位居肿瘤相关死亡率第三位,进展期胃癌术后五年生存率低。在胃癌发生的过程中,基因的异常表达调控起到不可或缺的作用。基因的异常表达调控会对细胞多种功能起到直接或间接影响。RRP12(ribosomal RNA processing 12 homolog),参与真核生物核糖体亚基的成熟和转运,是一种RNA结合蛋白。RRP12是一种核蛋白,但是它可以穿过核膜参与pre-rRNA的运输与装配。RRP12主要参与核糖体40S和60S亚基前体的核外运输。虽然RRP12的表达缺失会削弱60S和40S亚基的核外运输,但是RRP12缺失后酵母的核糖体总量变化不大。并且已有研究证明RRP12可以调节酵母的细胞周期和DNA损伤应答。目前仅有的研究证明,在骨肉瘤细胞中,RRP12可以增强细胞对化疗药物的抗性,干扰RRP12表达后,p53的表达明显上调。但是RRP12促进细胞抵抗化疗药物,促进细胞增殖、调节p53表达的机制尚不清楚。RRP12在其他肿瘤中的作用也未见报道。我们首次研究了 RRP12在胃癌中的作用及其调控机制,发现RRP12可通过调控p21的表达促进细胞增殖,抑制细胞衰老,促进胃癌的发生。实验目的研究RRP12在人胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况,以及干扰RRP12对胃癌细胞增殖、细胞衰老和细胞周期进程的作用,并阐明其作用的分子机制,为评价RRP12作为一种新的胃癌诊断标志物和治疗靶点的可行性提供数据支持。实验方法1.RRP12在人胃癌组织标本中的表达免疫组化检测癌旁和胃癌组织切片中RRP12的蛋白表达水平,评估其是否能作为胃癌的潜在诊断标志物。2.RRP12对在体外胃癌细胞生物学行为的影响检测不同的胃癌细胞系中RRP12 mRNA的表达水平。利用包被有RRP12干扰序列载体的慢病毒(Lentivirus-RRP12)和阴性对照(Lentivirus-negative control)处理RRP12表达水平较高的两个细胞BGC823和AGS,并构建稳定干扰RRP12的细胞株。检测稳转细胞系中RRP12的mRNA和蛋白表达水平。稳定干扰RRP12细胞系的增殖能力通过CCK8和克隆形成检测;通过β-半乳糖苷酶染色实验检测干扰RRP12对胃癌细胞衰老的影响;稳定干扰RRP12细胞系细胞周期变化通过PI染色后流式细胞术检测;稳定干扰RRP12细胞系的迁移和侵袭能力通过transwell实验检测。3.RRP12对在体内胃癌细胞生物学行为的影响Western blot检测稳转细胞系中RRP12的表达水平,将对照和稳定干扰RRP12表达的细胞注射到裸鼠腋下或尾静脉,检测RRP12在体内对胃癌细胞功能的影响。4.RRP12调控细胞增殖和细胞周期的分子通路稳定干扰RRP12的BGC823、AGS细胞株与其对照细胞提取总蛋白,检测与调控细胞周期进程、影响细胞增殖和细胞衰老相关的关键分子,包括p53、p21、p27及细胞周期调控蛋白,明确RRP12调控细胞增殖和细胞周期进程的分子机制。。5.RRP12是否通过p53调控p21的表达在稳定干扰RRP12的BGC823和AGS细胞株与对照细胞中检测p21 mRNA的表达水平变化。筛选稳定干扰RRP12的AGS细胞株,干扰p53后检测p21的表达变化。稳定干扰RRP12的AGS、BGC823细胞株,加入环己酰胺孵育0、15、30、60、90、120min后提取蛋白,检测p21半衰期的变化。过表达RRP12并加入MG132处理后检测p21的表达变化。6.Co-IP与质谱寻找与RRP12相互作用蛋白首先通过co-IP实验获取与RRP12相互结合的蛋白,通过质谱技术进行RRP12结合蛋白的定性检测,根据western blot结果筛选调控细胞衰老、细胞周期的关键效应分子。最后通过co-IP确定该分子与RRP12的相互作用。7.幽门螺杆菌对RRP12在胃癌细胞中表达的影响使用幽门螺杆菌Hp11637和Hp26695感染胃癌细胞,MOI=100。感染2、4、6和8小时后收取细胞,Western blot检测各组中RRP12蛋白表达水平。实验结果1.RRP12在胃癌临床组织标本中高表达IHC结果显示胃癌组织中RRP12表达水平明显高于癌旁组织,RRP12主要表达在细胞质中。2.干扰RRP12的表达抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,诱导胃癌细胞衰老和细胞周期停滞QRT-PCR结果表明,RRP12在BGC823和AGS细胞中表达较高;利用包被有RRP12干扰载体的慢病毒(Lentivirus-RRP12)感染胃癌细胞BGC823和AGS,构建稳定干扰RRP12的细胞株。稳定干扰RRP12的细胞株中RRP12的mRNA和蛋白表达均低于对照细胞。细胞功能实验表明,稳定干扰RRP12细胞株的克隆形成能力显著降低和细胞增殖能力显著降低(***P<0.001);β-半乳糖苷酶染色结果显示,干扰RRP12后实验组衰老的细胞数量明显增多(**P<0.01);流式细胞术分析细胞周期结果显示,下调RRP12后,胃癌细胞S期细胞数量显著减少,G1期细胞数量明显增多,G1期到S期的进程受到抑制(*P<0.05);transwel实验表明,稳定干扰RRP12细胞株的迁移和侵袭能力显著减弱(***P<0.001,***P<0.001)。3.干扰RRP12后胃癌细胞在体内增殖和转移能力受到抑制Western blot首先确定稳定干扰RRP12的BGC823细胞中RRP12表达明显低于对照细胞。随后腋下注射细胞,对照组观察到瘤体后开始测量,记录。记录完成后处死裸鼠,对瘤体拍照、称重。结果表明,与对照组相比,稳定干扰RRP12的胃癌细胞在体内的增殖能力明显弱于对照细胞(**P<0.01,***P<0.001)。裸鼠尾静脉注射胃癌细胞,35天后进行活体成像,结果显示对照组的荧光强度明显高于干扰组(**P<0.01)。处死裸鼠并解剖,肝肺荧光信号采集后发现对照组细胞比稳定干扰RRP12的胃癌细胞肝和肺部转移能力更强(*P<0.05)。肉眼观察发现,实验组肿瘤结节少于对照组,实验组肝肺的体积也小于对照组,实验组肺重量明显小于对照组(**P<0.01)。肝和肺部瘤体切片H&E染色结果显示RRP12干扰组裸鼠肝部和肺部肿瘤转移明显减少。4.下调RRP12的表达影响p21相关信号通路中分子的表达Westernblot检测发现,稳定干扰RRP12的细胞株,AGS和BGC823细胞中p21、p27的蛋白表达水平高于对照细胞,CDK2、CDK6和cyclin E1蛋白表达水平低于对照细胞,p53、p16的表达无差异,提示RRP12可能通过负向调控p21的表达诱导胃癌细胞衰老逃逸和促进细胞周期进程。5.RRP12通过不依赖于p53的途径调控p21的表达在稳定干扰RRP12的BGC823和AGS细胞株中,我们通过qRT-PCR检测发现p21 mRNA的水平并没有明显变化(nsP>0.05)。同时干扰RRP12和p53的AGS细胞中p21的蛋白水平显著低于只干扰RRP12的AGS细胞中p21的水平,但是明显高于只干扰p53胃癌细胞中的p21的表达水平。因此我们推测,RRP12可能通过独立于p53的方式调控p21的表达。加入环己酰胺抑制蛋白质合成后,干扰RRP12,p21降解速率明显变慢,半衰期延长(***P<0.001)。因此,在胃癌细胞中RRP12可能通过促进p21的降解调控p21的表达。随后,过表达RRP12并加入泛素化蛋白酶体抑制剂MG132,结果显示加入MG132可以显著上调由过表达RRP12引起的p21的表达降低。因此,RRP12可以通过泛素化蛋白酶体途径调节p21的表达。6.RRP12通过与SKP1相互作用调控p21的降解为进一步明确RRP12调控p21的机制,我们在胃癌细胞中做了 co-IP实验和质谱检测。结果提示RRP12可以与SKP1相互作用。Western blot检测发现干扰RRP12表达后SKP1蛋白水平并没有明显变化。我们猜测RRP12通过影响SCF复合物的稳定性促进p21的降解诱导胃癌细胞的衰老逃逸和细胞周期停滞。7.幽门螺杆菌能够上调胃癌细胞中RRP12的表达水平Hp11637和Hp26695以MOI=1:100感染BGC823和AGS细胞,分别感染2、4、6和8小时后,Western blot结果显示BGC823和AGS细胞中RRP12蛋白水平逐渐升高。