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重症肌无力(MG)公认为神经肌接头(NMJ)处的自身免疫性疾病，其发病机制系乙酰胆碱受体抗体(AChRAb)与肌-烟碱型乙酰胆碱受体(肌-nAChR)结合，阻碍乙酰胆碱(ACh)传递。近年有研究表明MG患者存在多种中枢神经系统(CNS)受损症状和神经电生理检查异常。有研究提示，部分MG患者的CNS受损可能由AChRAb与神经-烟碱型乙酰胆碱受体(神经-nAChR)免疫交叉结合引起，但仍缺乏有力的实验证据。 目的：从离体细胞水平探讨AChRAb是否能与培养神经元表面的神经-nAChR免疫交叉结合，并引起神经元生理活性改变。 方法：提纯正常人及MG患者IgG。体外培养SD大鼠与昆明种小白鼠神经元及TE671细胞株。随机选取TE671细胞和SD大鼠皮层、脑干、海马神经元，分为实验组和对照组作间接免疫荧光双标记。实验组分为两组，一抗用MG患者IgG分别与NF-160和β-Tubulin作双标；对照组也分为两组，一抗用正常人IgG分别与NF-160和β-Tubulin作双标。为明确MG患者IgG结合的是否烟碱型乙酰胆碱受体，再选取SD大鼠神经元，分为实验组和对照组作间接免疫荧光双标记。实验组一抗用MG患者IgG与VAChT作双标；对照组用正常人IgG与VAChT作双标。以上结果在共聚焦荧光显微镜下观察并行荧光像素密度分析。为再次证实，选取昆明种小白鼠皮层神经元行ABC免疫细胞化学染色。实验组一抗用MG患者IgG标记；对照组一抗用正常人IgG标记。为观察这种免疫结合对神经元生理活性的影响，随机选取SD大鼠皮层神 第叫军【）｛学颀f：学位论文 经元行胞浆钙测定：实验组按不同滴度加 MG患者经灭活补体血请，对照组 按不同滴度加正常人经灭活补体血渭（含空白对照）。血请作用2，4，6，sh 后分别加入FllJ。－3－AM，经孵育、冲洗后在荧光显微镜下观察并测定荧光像素 密度，它反映细胞内的Cay浓度动态变化。待基线平稳后加入nAChR激动剂 氨甲酚胆硷，检测神经元胞内钙变化，行统计分析。 结果：实验组TE671细胞呈绿色荧光，对照组TE671细胞则无，证明MG 患者 IgG中含有 AChRAb，可与 TE671细胞表面特异性表达的肌－nAChR结合， 正常人血清中则无AChRAb。实验组神经元呈双标，对照组呈单标，三种来源 的神经元实验组均发出绿色荧光，以胞膜和树突为著，对照组则无绿色荧光， 证明皮层、脑干、海马神经元均可与AChRAb结合。 VAChT和MG患者屹G双标记发现实验组MG患者屹G与VAChT共定 位，证明MG患者IgG中含有的AChRAb可与胆碱能神经元的nAChR结合。 ABC免疫细胞化学反应发现实验组昆明种小白鼠免疫反应阳性，对照组则无。 荧光像素密度分析说明TE671细胞表达的nAChR数量显著高于神经元上的 nAChR数量，而皮层、脑干、海马神经元表面dCM数量差异不显著。胞浆 钙测定可见实验组神经元形态改变，胞内钙超载，钙超载的程度和速度与患者 血清滴度和作用时间相关，对照组神经元和实验组中神经胶质细胞未见明显变 化。实验组神经元静息钙不稳，对氨甲酞胆碱的反应性降低。 结论：①MG患者AChRAb可与神经－nAChR受体免疫交叉结合。②部分 MG患者CNS受损的可能机制之一是AChRAb与神经－nAChR结合，抑制钙 正常内流，影响神经元对神经递质的反应性。③AChRAb阴性的MG患者有 无可能系CNS内产生针对神经－nAChR自身抗体所致需要深入研究。