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淀粉作为作物籽粒的主要组成成分,不但是人类最主要的食物来源和家畜的饲料来源,而且是重要的工业原料,广泛应用到食品、化工和生物能源等领域。随着经济的快速发展和人民生活水平的提高,人们对淀粉的需求将有增无减。因此提高淀粉产量对于国民经济具有十分重要的意义。植物中淀粉的生物合成至少需要4种酶的协同作用,分别为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase;AGPase),淀粉合成酶(starch synthase;SS),淀粉分支酶(starch branching enzyme;SBE),淀粉去分支酶(starch-debranching enzymes;DBE)。在作物胚乳中利用突变体分析已鉴定了多个影响胚乳淀粉合成的关键基因。前期研究通过提高单个关键基因表达并没有显著提高淀粉含量,而一些研究发现同时提高多个淀粉合成基因的表达能使淀粉含量显著提高。利用转录因子同时提高这些淀粉合成基因的表达是一个有效的途径,然而目前已鉴定的淀粉相关转录因子大都在胚乳中大量表达,不利于通过基因工程提高淀粉含量。因此,筛选和鉴定能同时调控多个淀粉相关基因表达的异源转录因子就显得尤为重要。淀粉合成通常受到各种糖和激素的转录调控,目前多项研究表明蔗糖和ABA能协同调控作物胚乳淀粉合成相关基因的表达,然而其分子机制至今还鲜见报道。为了鉴定能同时调控多个胚乳淀粉相关基因表达的异源转录因子,我们对玉米淀粉合成关键基因Sh2的启动子进行了分析并进一步鉴定了调控玉米胚乳淀粉合成关键基因的转录因子。同时为了研究蔗糖和ABA协同调控玉米胚乳淀粉合成的分子机制,我们对蔗糖和ABA协同调控相关的候选转录因子进行了功能分析。主要研究结果如下:1.鉴定了影响Sh2启动子活性的关键顺式作用元件。我们从玉米骨干自交系中克隆了Sh2启动子翻译起始点上游2539 bp的序列并对其进行了顺式作用元件分析,启动子活性分析发现玉米Sh2基因第一内含子显著影响启动子活性。通过一系列5’缺失突变和连续定点突变,我们发现在玉米Sh2启动子区域的一个RYrepeat元件(-917至-910)显著影响启动子活性。2.胚乳异源表达转录因子VP1能直接与RYrepeat元件相结合调控Sh2基因的表达。由于前期报道VP1能与RY repeat结合调控基因表达,我们利用基因枪介导的瞬时表达技术将VP1在胚乳中异源过表达后发现VP1能激活Sh2启动子活性,而RYrepeat突变后的启动子则不能被VP1激活。为研究VP1是否能与RYrepeat直接结合,我们通过原核表达并纯化了带His标签的VP1B3保守结合域蛋白,同时合成并标记了含RY repeat的40-bpSh2启动子片段,凝胶阻滞电泳分析发现VP1/B3蛋白能与含RY repeat的片段结合,未标记的40-bp探针能竞争与VP1/B3蛋白结合,而RY repeat突变探针则不能竞争结合,表明VP1能与含RY repeat的40-bp片段特异结合。3.VP1能激活其它淀粉合成相关基因的表达。通过对玉米胚乳淀粉合成相关基因启动子进行分析发现启动子中富含RY repeat元件。我们通过瞬时表达分析发现胚乳异源过表达VP1也能激活淀粉合成关键基因Bt2,Ss1和Su1启动子活性。因此,VP1能调控多个胚乳淀粉合成关键基因的表达。4.ZmW KR82.2主要在玉米种子中表达且能被蔗糖和ABA协同诱导。序列分析表明ZmWRKY82.2是一个典型的Ⅰ类WRKY转录因子,在不同作物中存在多个同源基因,亚细胞定位分析发现该转录因子定位于细胞核,酵母激活实验表明ZmWRKY82.2具有转录激活活性,Real-time PCR分析发现ZmWRKY82.2基因主要在玉米种子中表达,通过对蔗糖和ABA处理的胚乳中ZmWRKY82.2的表达分析发现该基因受蔗糖和ABA的协同诱导。5.ZmWRKY82.2能与玉米胚乳淀粉合成相关基因启动子相结合并诱导启动子的活性。我们利用酵母单杂交试验发现ZmWRKY82.2能与Bt2、Ae、Sbe1、Su1、Agps2、Agpl3、Wx和Du1启动子在酵母体内相结合。瞬时表达分析发现ZmWRKY82.2能诱导Ae,Bt2,Sbe1和Su1启动子的活性,而对Du1和Wx启动子则没有诱导作用,表明ZmWRKY82.2能介导蔗糖和ABA对玉米胚乳淀粉合成关键基因的阳性调控。