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本研究建立了猪外周血单核细胞来源树突状细胞体外培养模型,并从免疫发病猪猪场发病猪体内分离到一株PRV野毒株,观察了IRPS和PRV CH-HN野毒株在影响DC成熟和功能中的作用,同时研究了IRPS在PRV影响DC成熟和功能中的调节作用,初步探讨PRV的致病机制,探索IRPS作为免疫增强剂和抗病毒药物在调节DC成熟以及调节PRV对DC成熟和功能影响中的作用机制。本研究共分五部分,试验一：猪外周血单核细胞来源树突状细胞体外培养模型的建立。采用淋巴细胞分离液梯度离心获得猪外周血单核细胞,贴壁法分离目的细胞,利用IL-4、GM-CSF双因子法诱导分化未成熟DC,加入LPS 48h刺激成熟。形态学观察发现imDCs表面粗糙,有大量褶皱,毛刺样突起较少,且较短小；而mDCs具有明显的形态学特征,体积增大、表面大量树枝样突起。流式细胞仪检测结果表明不同培养阶段猪MoDCs均表达CD172a、CD1、CD80、CD86和SLA-II-DR(猪MHCⅡ),且mDCs的CD172a、CD1、CD80、CD86和SLA-Ⅱ-DR表达率分别为55.2%、53.6%、43.6%、65.4%和61.1%,均较imDCs表达率53.8%、42.4%、23.4%、54.2%和48.2%明显升高。对DC功能研究表明imDC具有较强的吞噬功能,但其刺激同种淋巴细胞增殖能力较弱,而mDC吞噬能力较弱,但其刺激同种淋巴细胞增殖能力增强。结果表明GM-CSF (20ng/mL)、IL-4 (20ng/mL)共同作用后加入LPS (100ng/mL)可刺激诱导分化到大量的成熟MoDCs,成功建立体外诱导培养猪外周血MoDC培养模型。试验二：IRPS对猪MoDC成熟和功能的影响。获得未成熟DC,选择不同浓度区间的IRPS处理细胞,确定安全浓度范围为20 ng/mL～2μg/mL,其中最适浓度为100 ng/mL。以LPS (100ng/mL)刺激成熟DC为对照,采用IRPS (100ng/mL)刺激48h。倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态,发现安全浓度范围内以0.1 μg/mL浓度的IRPS可诱导DC形成典型的树突状突起,树突的形成较LPS作用下更为明显、典型。流式细胞仪分析DC表面分子证明IRPS具有促进DC表型成熟作用；IRPS处理组和LPS处理组各表型比较差异显著,表明IRPS作用强于LPS处理组(P<0.05)。混合淋巴细胞反应检测DC刺激同种异体T淋巴小增殖的能力,结果显示,IPRS能促进DC对T细胞的激活能力,且和LPS处理组之间比较差异显著(P<0.05),表明IRPS刺激同种异体T细胞增殖能力强于LPS。IRPS处理DC吞噬能力较阴性对照组明显降低,且差异显著,表明IRPS可抑制DC吞噬功能,表明IRPS具有体外刺激MoDC形态、表型和功能成熟的作用。试验三：采集河南、山东等地发生疑似伪狂犬病免疫猪场死亡仔猪的脑组织,通过病毒增殖、空斑试验纯化、PCR检测病毒特异gE基因、动物回归试验及病理组织学观察,成功分离到毒株PRV CH-HN。该分离株在Vero细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,致病性试验出现原地抽搐、行走转圈等伪狂犬神经症状。对发病仔猪组织病料进行病理组织学试验,观察到脑组织神经炎和核内包涵体等典型病理变化。通过对病毒囊膜蛋白gE基因进行克隆和序列比较分析,发现该毒株与目前国内流行毒株同在一个分支上,将其命名为PRV CH-HN株。试验四：PRV感染未成熟DC后可降低CD1a、CD172a、CD80、CD86、SLAII等表面分子的表达,其中CD172a,CD80,CD86,SLAII表型显著下降(P<0.05),表明PRV感染imDC后可抑制imDC表型成熟。PRV感染成熟DC可抑制表面分子表达,以CD86和MHCII受抑制最为明显。混合淋巴细胞反应(MLR)检测结果表明PRV感染成熟DC后可抑制成熟DC对T细胞的激活能力,较LPS-DC对照组显著下降(P<0.05)。抗体芯片检测各组细胞上清中的IL-1β、IL-10、IL-12和TNF-a表达水平。结果表明未成熟DC和成熟DC正常情况下均可表达一定水平的IL-1β和TNF-a,生成较高含量的IL-12和极少量IL-10,且LPS刺激后可显著提高IL-1β、TNF-a和IL-12的表达。PRV感染未成熟DC可显著促进未成熟DC分泌IL-1β、IL-10和TNF-a的生成,而IL-12的含量均明显下降；PRV感染成熟DC显著降低IL-1β、TNF-a和IL-12的生成,显著促进IL-I0的分泌。小结：PRV抑制imDC成熟和mDC功能来发挥其感染作用。试验五：研究IRPS对PRV影响DC表面分子表达的调节。结果表明IRPS可显著抑制PRV感染对DC表型的下调。IRPS+PRV组CD1a、CD172a、CD80、SLAII表达水平均较LPS+PRV组高(P<0.05),CD86表达水平较LPS+PRV组低(P>0.05)。IRPS可显著抑制PRV感染对DC刺激T细胞增殖能力的降低,IRPS+PRV组DC刺激同种异体T细胞增殖能力显著高于LPS+PRV组(P<0.05)。抗体芯片检测结果表明IRPS能抑制PRV感染DC下调IL-1β和TNF-a分泌的作用,显著抑制IL-I0的分泌,显著增强IL-12的分泌。Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡,结果表明PRV感染可诱导细胞凋亡,IRPS可显著促进PRV感染DC所诱导的细胞凋亡。小结：IRPS可以抑制PRV感染对MoDC成熟和功能的影响。结论：1.成功建立猪外周血单核细胞来源树突状细胞体外诱导分化培养模型。2. IRPS可促进MoDC成熟并增强其生物学功能。3.从免疫猪场疑似伪狂犬病病料中分离到野毒株PRV CH-HN.4.PRV感染可抑制imDC成熟、降低成熟DC表面分子表达并抑制其生物学功能。5.IRPS显著抑制PRV感染对DC成熟和功能的影响,促进PRV诱导的细胞凋亡。