论文部分内容阅读
特发性炎症性肌病（IIM）是一组异质性的急性、亚急性或慢性起病的罕见的获得性骨骼肌炎性疾病。其临床表现为肌肉无力，肌酸激酶升高，肌电图非特异性异常等，常累及多脏器病变，病变严重时危及生命[1-3]，目前其确切发病机制不清。根据临床病理特征主要将其分为多发性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）、包涵体肌炎（IBM）和免疫介导的坏死性肌炎（IMNM）。由于多发性肌炎的发病机制不清，治疗效果不理想，因此我们拟通过肌炎动物模型来进行研究。目前较好的动物模型是肌浆球蛋白诱导的实验性自身免疫性肌炎（EAM）模型，其在多个方面都与PM[4]相似，为我们研究IIM提供了良好的基础。本研究中采用的模型为我们前期通过改变肌球蛋白注射剂量和注射辅剂的时间得到的改良EAM模型，其特点为用时短、重复性强、稳定可靠。我们前期的研究中观察EAM模型2个月，发现炎症逐步加重，在14天时炎症最严重，然后炎症稍有减弱，28天后基本成稳定的炎症状态，因此我们选择0天、14天和28天3个时间点来进行实验。大量的报道证实，Tregs和Th17细胞之间的失衡与多种自身免疫性疾病有关[5-7]。Tregs是在自身免疫性疾病中的起保护作用的细胞，Th17细胞通过诱导各种促炎反应增强自身免疫反应的进展。但这些研究都没有阐明PM中，Tregs和Th17细胞之间到底如何变化？故本研究通过观察Tregs和Th17相关的细胞因子的变化情况，尝试发现这些因子在肌炎发病过程中的可能作用。目的观察Tregs的转录因子Foxp3及相关的细胞因子（IL-10、TGF-β）和Th17相关的细胞因子（IL-6、IL-17、IL-23）在EAM发病过程中的变化规律，探讨这些因子在肌炎中的可能作用以及这些因子与两种细胞的相关性，从而尝试找出调节两种细胞变化的关键因子。方法将健康成年雌性BALB/c小鼠（体重15~18g，5~6周龄）随机分为3组，每组5只：第一组为0天处理组（正常组)，第二组为EAM14天处理组，第三组为EAM28天处理组。进行肌力测定和组织病理学评分；采用实时荧光定量PCR检测小鼠肌肉和脾脏中Tregs的转录因子Foxp3及相关的细胞因子（IL-10、TGF-β）和Th17相关的细胞因子（IL-6、IL-17、IL-23）mRNA的表达水平；采用Luminex液相芯片技术检测小鼠血清中IL-6，IL-17和TGF-β1的表达水平。结果1．0天处理组小鼠肌力均超过30分钟，EAM处理组小鼠肌力均明显下降，以EAM14天处理组肌力下降最明显，三组间均有统计学差异（P<0.01）；组织病理学评分：0天处理组0分，EAM14天处理组3.05±0.190分，EAM28天处理组1.85±0.105分，在14天时炎症最为严重，28天时略有好转（P<0.01）。通过光镜下观察发现，0天处理组小鼠的肌纤维是多角形，大小基本一致，细胞核多位于肌纤维周边，I型（深染）与II型（浅染）肌纤维清晰可见；EAM14天处理组小鼠的肌纤维大量炎症细胞浸润，肌纤维大小不等，可见散在分布的坏死、再生纤维；EAM28天处理组小鼠的肌纤维炎症程度稍减轻，但仍有较多炎症细胞浸润。2．在小鼠肌肉组织的mRNA中，Tregs相关的细胞转录因子Foxp3在0天时表达较低（0.697±0.322），在14天时略有升高（1.274±0.547），在28天时显著增加（16.491±7.884）；IL-10在0天时表达较低（1.010±0.479），在14天时显著增加（5.670±2.979），28天时下降（2.648±0.633）；TGF-β在0天时表达较高（0.576±0.250），在14天时有所下降（0.358±0.186），在28天时显著降低（0.094±0.075）。Th17相关的细胞因子IL-6、IL-17和IL-23变化规律从0→14→28天都为持续上升趋势，28天增高最为显著（IL-6：0.459±0.308，0.636±0.113，1.477±0.224；IL-17：0.718±0.208，2.197±0.295，19.237±2.126；IL-23：0.754±0.296，2.035±1.050，20.158±11.188）。3．在小鼠脾脏组织的mRNA中，Tregs相关的细胞转录因子Foxp3从0→14→28天为持续增高，28天增高最显著（0天：1.017±0.080；14天：1.908±0.675；28天：4.992±1.924）。相反，其相关的细胞因子IL-10和TGF-β则均为下降趋势，14天时就下降显著，28天继续降低（IL-10：0.994±0.147,0.223±0.057,0.183±0.043；TGF-β：0.697±0.188,0.063±0.104,0.063±0.058）。Th17相关的细胞因子IL-6在0天时表达较高（0.507±0.384），在14天时显著下降（0.066±0.163），在28天时略有升高（0.167±0.069）；IL-17在0天时表达较低（1.269±0.293），在14天时略有升高（2.681±0.305），在28天时显著增加（10.252±1.672）；IL-23无明显变化。4．在小鼠血清中， IL-6，IL-17和TGF-β1的表达水平三者均为在0天时最低，14天时达到高峰，28天时有所下降，但仍高于0天，与肌肉组织的炎症程度一致。（IL-6:0，35.840±3.094，3.740±1.108；IL-17：0，35.130±5.524，10.120±3.579；TGF-β1：2413.100±223.563，3861.600±317.621，2895.800±366.154）。结论1.在EAM的发病过程中，Tregs的转录因子Foxp3及相关的细胞因子IL-10、TGF-β和Th17相关的细胞因子IL-6、IL-17、IL-23都有不同的显著变化，总的趋势为前者下降，后者增高，提示Tregs和Th17之间的失衡在肌炎发病机制中起重要作用。2.在肌炎的14天升高的细胞因子有IL-10和IL-17，说明其在早期的炎症反应时发挥重要作用；在28天时仍升高的细胞因子有IL-6、IL-17、IL-23，说明这些细胞因子可能与炎症的持续发展有关。3.在肌炎发生发展过程中，小鼠脾脏中的IL-6、IL-10和TGF-β逐步降低，提示脾脏作为T淋巴细胞的增殖场所，调控体内T淋巴细胞的分布，使T淋巴细胞经过再循环后重新分布，使这些因子向肌肉炎症部位归巢，从而发挥其免疫作用，说明脾脏在肌炎的发生发展过程中起重要作用。4.在肌肉组织炎症发展过程中，IL-6逐步上升，TGF-β逐步下降，在14天时可能达到合适比例发挥其最大的作用，在两者共同作用下，导致14天后IL-17迅速显著增高，28天时达到最高，提示IL-6的增加可能使初始T细胞更多的转化为Th17细胞，所以通过阻断IL-6，可能为治疗肌炎提供了一个理想的治疗靶点。