背景与目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种生物学和预后相差显著的严重危害人类健康的常见造血系统恶性肿瘤。化疗一直是AML传统的治疗手段,目前60%-80%的AML患者经标准化疗后可以获得完全缓解(complete remission,CR),但即使获得CR后通过巩固治疗、定期强化和维持治疗,无病生存率仍徘徊于40%—50%的低水平间,多数由于对抗白血病药物产生多药耐药而使治疗失败。AML具有复杂的异质性,不同亚型AML的治疗方法不同,预后也有很大差别。患者的年龄和遗传学改变是初诊AML的主要预后因素,大约55%的AML都存在细胞遗传学的异常。此外高白细胞数、达缓解时间延迟、继发白血病等被认为是白血病的不良预后因素。通过SNP、基因芯片等技术已证实,许多基因突变和基因表达异常与白血病的预后相关,如具有CEBPA、NPM1基因突变的AML预后较好,而WT1突变、P53突变、MLL突变和FLT3—TKD突变的AML预后则较差。伴有Sorcin、EGR、BAALC、MN1等基因高表达的白血病预后也较差。而MLL-PTD对AML预后无影响。因而根据细胞遗传学和分子遗传学诊断与预后分析,采取靶向治疗和个体化治疗相结合的手段,将进一步提高白血病治疗效果。文献检索及生物信息学分析发现,血管生成素2(angiopoietin2, Ang2)位于8p21,相对分子质量约为75×103,全长496个氨基酸,约6096与Ang1相同,分子结构也与Ang1类似,均包括9个外显子和8个内含子。Ang2是一个内皮特异性生长因子,主要表达于血管重塑活跃的部位及血管高度增生的肿瘤组织,可能是肿瘤血管生成的早期信号,其表达增多是肿瘤快速增长并易于发生转移的一个早期标志。Ang2基因在胃癌、乳腺癌、肝癌、血管瘤及胶质瘤中表达增高,并与胃癌的进展密切相关。逆转录酶PCR (Reverse transcripase polymerase chain reaction, RT-PCR)方法分析Ang2在CD7(+)AML高表达,而t(8；21)的AML低表达,经化疗达完全缓解后Ang2水平表达降低,不易检测到。免疫组化法分析证实Ang2在AML患者骨髓中高表达,且在慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)急变中Ang2表达高于慢性期患者。Martinelli等测定早期的B细胞慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)Ang2的表达,结果显示早期的B细胞慢性淋巴细胞白血病Ang2高表达与IgV(H)基因突变、骨髓血管增生相关。鉴于Ang2基因在实体瘤中的表达与作用,以及在白血病中的初步研究结果,本文通过实时荧光荧光定量PCR (Rreal-time quatitative PCR, RQ-PCR)技术检测Ang2在AML中的表达,旨在探索Ang2对AML的早期诊断、治疗及预后的影响有无意义,在各类型中表达有无差异,能否作为治疗的靶点。方法：1.研究对象：所有白血病骨髓标本均取自临床表现、细胞形态学和免疫分型及细胞遗传学特征确诊的患者,初治组98例,复发组13例,难治组10例,缓解组18例,正常对照组为年龄、性别匹配的健康供者16例。2.引物设计与合成：根据GeneBank的序列设计Ang2各基因及管家基因β-actin引物。3.提取白血病及健康供者骨髓单个核细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。取两管平均Ct值计算2-ΔCT值,作为各标本mRNA的相对表达量,△CT=(目的基因CT值-内参基因CT值)。比较AML初治组与正常对照组、初治组与缓解组、初治组与复发组、初治组与难治组、复发组与正常对照组、难治组与正常对照组、复发组与缓解组、难治组与缓解组、AML各亚型之间、各亚型与正常对照组之间Ang2mRNA表达水平有无统计学差异。以对照组表达水平中位数2倍为界,将研究对象分为高表达组与低表达组,比较初治组中首疗程CR组与NR(no complete remission)组、复发或进展为难治性白血病发生率、正常核型与预后不良核型组、3年内死亡病例组与3年内仍存活病例组患者骨髓单个核细胞Ang2mRNA表达水平差异,及高表达组和低表达组无病生存期和总生存期的差异。4.应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料呈非正态分布,用中位数描述；两组计量资料间分布比较用Mann-Whitney U test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation analysis;率的比较采用chi-square test;生存分析用Kaplan-Meier曲线；生存率比较用log-rank检验；单因素分析及多因素分析用Cox Regression;检验水准α=0.05,双侧检验。结果：1.RNA、cDNA纯度和质量分析：所提取总RNA、cDNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间。2.同一标本cDNA经10倍比稀释后,设6个梯度,测各梯度浓度,范围是8.1～258.8 ng／μl,分别对管家基因和目的基因进行扩增,6个梯度的ΔCT相差很小,说明在浓度范围内管家基因与目的基因的扩增效率一致,其CT值可以反应扩增基因的丰度。扩增后进入熔解程序生成熔解曲线,熔解曲线显示锐利的单一峰,无其它特异峰,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳显示Ang2基因所扩增片段条带单一,无引物二聚体和非特异性扩增。3.基因表达：AML初治组Ang2mRNA表达水平显著高于缓解组、正常对照组(Z=-3.470,0.001；Z=-2.570,P=0、010)；AML复发组Ang2mRNA表达水平显著高于缓解组、正常对照组(Z=-2.942,0.003；Z=-2.142,P=0.013)；AML难治组Ang2mRNA表达水平显著高于缓解组、正常对照组(Z=-3.549,P=0.000；Z=-3.322,0.001)；而初治组与复发组、难治组比较无统计学差异(Z=-0.945,P=0.345；Z=-1.537,P=0.124)。比较AML各亚型之间、各亚型与正常对照组、缓解组之间Ang2mRNA表达水平显著高于差异(共14组,P=0.0035为显著性差异的较正后的P值)发现,Ang2mRNA在M2亚型显著高于缓解组,各亚型之间比较无统计学差异。4.基因表达水平与临床的关系：将Ang2基因的表达水平与患者初诊时年龄、血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶水平和外周血白血病细胞比例及骨髓白血病细胞比例等指标做相关性分析,结果显示Ang2 mRNA表达水平在男女患者之间无统计学差异(Z=-0.587,P=0.557)。Ang2 mRNA表达水平与患者初治时年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、外周血原幼稚细胞比例、骨髓原幼稚细胞比例均无显著性相关,相关系数绝对值均小于0.3,P>0.05。5.与疗效的关系：依据对照组Ang2 mRNA表达水平中位数的2倍为界将患者分成两组,高于对照组Ang2mRNA表达水平中位数2倍定义为高表达组,低于对照组Ang2 mRNA表达水平中位数2倍定义为低表达组。初治组98例患者除去6例治疗不足1疗程即死亡和4例入院后未治疗即自动出院未列入统计外,其余88例均列入治疗反应分析。Ang2 mRNA高表达组57例,经首疗程化疗达到完全缓解(CR)28例(49.1%),未达CR(包括部分缓解和未缓解)29例(50.9%)；低表达31例,CR22例(70.9%),未达CR9例(29.1%)。x2检验显示两组CR率有显著性差异(P<0.05),低表达组首疗程CR率高于高表达组。将经标准剂量化疗2个疗程未达CR、第一次CR后6个月以内复发者、第一次CR6个月以后复发而用原诱导缓解方案治疗未达CR者、两次以上或多次复发者定义为难治性白血病。Ang2mRNA高表达组57例中复发和进展为难治病例共27例(47.5%),低表达组31例中共有7例复发或进展为难治病例(22.6%),两组难治性白血病发生率有显著性差异(P＜0.05),高表达组白血病的复发或进展为难治性发生率高于低表达组。88例列入统计分析的病例中有81例患者完成核型分析,正常核型39例,其中高表达Ang2 mRNA有27例(69.2%)；预后不良核型18例,其中高表达Ang2 mRNA有12例(66.7%),两者比较没有显著性差异(P＞0.05)。79例初发AML患者随访3年,其中高表达Ang2 51例中,3年内死亡26例(51.6%)；低表达组28例,3年内死亡8例(29.4%),高表达组与低表达组死亡率有显著性差异(P<0.05)。Log rank检验显示,两组3年总生存时间及无病生存时间亦有显著性差异(P=0.010,P=0.032)。结论：1.所提取RNA、cDNA纯度高、质量好,可用于后续实验。2.所设计的各基因引物特异性好、与管家基因扩增效率一致。3. Ang2 mRNA表达水平在AML初治组、复发组及难治组显著高于正常对照组和缓解组。初治组和复发组、初治组和难治组比较均没有显著性差异。AML各亚型之间、各亚型和正常对照组之间比较无统计学差异。M2亚型Ang2mRNA表达水平显著高于缓解组,其余各亚型与缓解组比较无统计学差异。4.将各基因表达水平与患者初诊时年龄、血红蛋白、白细胞、血小板、乳酸脱氢酶水平和外周血白血病细胞比例及骨髓白血病细胞比例等指标做相关性分析发现,Ang2 mRNA表达水平与患者初治时年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、外周血原幼稚细胞比例、骨髓原幼稚细胞比例均无显著性相关,相关系数绝对值均小于0.3,P>0.05。5.正常核型组与预后不良核型组比较没有显著性差异,从侧面提示Ang2有可能成为评估AML早期诊断的一个独立指标。6.AML患者骨髓单个核细胞高表达Ang2 mRNA首疗程CR率低,难治性白血病发病率高。Ang2基因表达水平可能可作为评估治疗反应的指标。7.高表达Ang2mRNA的AML病例3年内死亡率高于低表达病例,且无病生存期和总生存期均显著低于低表达组。单因素及多因素分析结果示Ang2mRNA表达水平越高患者死亡风险越大。高表达Ang2mRNA的AML患者预后差。